$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Internalizacja bakterii w komórkach gospodarza (mikroskopia fluorescencyjna)
Uwaga: P. gingivalis jest oznaczony 2',7'-Bis-(2-karboksyetylo)-5-(i-6)-karboksyfluoresceiną, estrem acetoksymetylowym (BCECF-AM). BCECF-AM jest barwnikiem nieprzepuszczalnym dla membrany; jego konwersja do fluoresceiny BCECF poprzez działanie esterazy wewnątrzkomórkowych może wskazywać na żywotność komórek. P. gingivalis jest znakowany barwnikiem BCECF-AM, a następnie używany do infekowania komórek eukariotycznych. Po zakażeniu komórki są utrwalane i znakowane DAPI i TRITC-falloidyną. Barwnik DAPI używany do barwienia jądra komórki eukariotycznej będzie również oznaczał jądro komórki bakteryjnej, co stanowi środek zaradczy w celu identyfikacji niezdolnych do życia bakterii, które nie mogą metabolicznie rozszczepić BCECF-AM. Komórki gospodarza są podkreślone TRITC-falloidyną, czerwonym barwnikiem aktyny.
- Szkiełka nakrywkowe w autoklawie. Asepcie dodawać szkiełka nakrywkowe do płytek 12-dołkowych przed wysiewem komórek śródbłonka w ilości 5 x 104 komórek/dołek. (Przygotowane dzień przed eksperymentem)
- Przygotować komórki śródbłonka na okrągłych szkiełkach nakrywkowych o grubości 18 mm (#1,5) w płytkach 12-dołkowych, jak opisano powyżej.
- Przygotować bakterie beztlenowe wyhodowane do fazy środkowej (OD660 = 0,5-0,7).
- Przemyć bakterie 2x beztlenowym PBS, odwirowując przy 5,000 x g i zawieszając osad w PBS przy 5-7 x 108 komórek/ml.
- Dodać 20 μl 0,2 mM BCECF-AM do 2 ml zawiesiny bakteryjnej (5-7 x 108 komórek/ml) do końcowego stężenia BCECF-AM wynoszącego 2 μM.
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności.
- Płytki transferowe z komórkami śródbłonka wysianymi na okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 18 mm (#1,5) z inkubatora kultur tkankowych do komory beztlenowej. Przemyć PBS i wymienić na beztlenowe podłoże VEGF.
Uwaga: Sprawdź, czy HUVEC są zdrowe pod mikroskopem świetlnym. HUVECS powinien być ~80% zlewny, morfologia powinna być porównywalna z producentami.
- Odwirować znakowane bakterie przy 5 000 x g przez 10 minut, aby usunąć resztki barwnika BCECF-AM. Zawiesić w 2 ml beztlenowej pożywki VEGF.
- Zainfekuj komórki gospodarza znakowanymi bakteriami w MOI 100:1 (bakterie: gospodarz).
- Inkubować w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Po zakażeniu trzykrotnie przemyć komórki PBS i umieścić w świeżo przygotowanym 4,0% paraformaldehydzie przez 10 min.
nuta: Po utrwaleniu komórek eksperymenty można przeprowadzać poza komorą beztlenową.
- Umyj szkiełka nakrywkowe PBS trzykrotnie.
- Dodać 1 ml 0,2% Triton X-100 przez 10 min.
- Umyj szkiełka nakrywkowe PBS trzykrotnie.
- Dodać 50 μl falloidyny TRITC (50 μg/ml) do szkiełek nakrywkowych na 45 min.
- Umyć szkiełka nakrywkowe trzy razy, wyjąć z płytki 12-dołkowej i umieścić na szkiełku podstawowym z miękko osadzonym podłożem montażowym zawierającym DAPI. Uszczelnij boki lakierem do paznokci.
nuta: Slajdy mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w ciemności. Unikaj ekspozycji na światło, aby zapobiec wybielaniu zdjęć.
- Oglądaj preparaty za pomocą mikroskopu konfokalnego.
- W tym przypadku należy użyć 34-kanałowego systemu spektralnego (32-kanałowy detektor matrycowy i dwa boczne detektory PMT oraz detektor światła przechodzącego) skonfigurowanego wokół stanowiska AxioObserver (odwróconego) z zmotoryzowanym stolikiem XY. System składa się z pięciu laserów: niebieskiej diody (405 nm), wieloliniowej Argon (458, 488, 514 nm), zielonej diody (561 nm), czerwonej HeNe (633 nm) oraz lasera impulsowego 440 nm. Wyposaż system obrazowania fluorescencji w 2 hybrydowe detektory GaAsP (dla FRET-FLIM).
- Wykrywaj fluorescencję z DAPI i TRITC w jednym kanale za pomocą dwupasmowego filtra o długościach fal wzbudzenia 340-380 nm i 540-560 nm oraz filtra emisyjnego odpowiednio 435-485 nm i 570-590 nm. Wykryj fluorescencję z BCECF-AM za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 440-500 nm i filtra emisyjnego 510-590 nm.
nuta: Kontrole BCECF-AM powinny być przeprowadzane na każdym badanym szczepie bakteryjnym, aby zapewnić prawidłowe oznakowanie żywych bakterii. Najpierw sprawdź, czy niezdolne do życia bakterie są DAPI-dodatnie i BCECF-ujemne. Po drugie, upewnij się, że żywe bakterie mogą metabolizować BCECF-AM do fluoresceiny BCECF. Zmienne stężenia bakterii lub barwnika BCECF-AM mogą wymagać przetestowania w celu uzyskania optymalnego oznakowania.