1. Hodowla, różnicowanie i walidacja komórek HL-60
- Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych HL-60 składającą się z 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) z L-glutaminą i 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej. Nie należy dodawać antybiotyków, ponieważ może to wpływać na różnicowanie komórek HL-60.
- Do rozmnażania/utrzymania komórek HL-60 należy hodować 5 x 106 komórek w 10 ml pożywki do hodowli komórek HL-60 w 75 cm2 wentylowanych kolbach w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2 ). Pasaż komórek co 3-4 dni, aby utrzymać optymalne stężenie komórek.
nuta: Stężenie komórek nie powinno przekraczać 5 x 106/ml.
- Generowanie zapasów roboczych komórek HL-60 poprzez porcjowanie około 1 x 106 komórek/ml w pożywce hodowlanej HL60 z 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) do probówek kriogenicznych o pojemności 1 ml.
nuta: Zapas roboczy może być przechowywany w temperaturze -80 °C. Materiał wzorcowy należy przechowywać w temperaturze -120 °C.
- Różnicować komórki HL-60 poprzez hodowlę 1,5 x 107 komórek w 15 ml pożywki do hodowli komórek HL-60 z 0,6% N, N-dimetyloformamidem (DMF) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sterylnych kolbach o średnicy 75 cm2 z filtrem przez 3 dni przed zabijaniem opsonofagocytarnym (OPKA).
- Sprawdzić, czy komórki HL-60 zostały pomyślnie zróżnicowane i nadają się do użycia w teście OPKA, testując markery żywotności i powierzchni komórek zgodnie z ustalonymi protokołami cytometrii przepływowej. Po różnicowaniu zbierz komórki HL-60 i wybarwij około 1 x 104 komórek fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami/barwnikami dla CD71, CD35, aneksyny V i jodku propidyny.
nuta: Zróżnicowane komórki powinny być ≥65% żywotne, ≥55% CD35+ i ≤20% CD71+, zgodnie z ustalonymi protokołami walidacji (Figura 1).
2. Przygotowanie i odczynników OPKA
- Przygotuj 50 ml sterylnego buforu opsonizacyjnego B (OBB), mieszając 42,5 ml sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z Ca2 + / Mg2+, 5 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i 2,5 ml 0,1% sterylnej żelatyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Zaopatrzyć się w uzupełnienie dla młodego królika i przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Uzyskać lub przygotować płytki do hodowli bakterii (tj. 15 x 100 mm2 5% płytki agarowe z krwią owczą).
3. Przygotowanie próbek bakteryjnych
- Uzyskać zapas szczepu(-ów) bakteryjnego(-ych), który ma być poddany(-e) badaniu.
UWAGA: W tym protokole stosuje się serotyp 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, hojnie dostarczony przez dr Moon Nahma).
- Hoduj szczep bakterii w odpowiednim bulionie (tj. bulionie Todda-Hewitta + 0,5% ekstraktu drożdżowego dla tego szczepu WU2) przez około 2−4 godziny w temperaturze 37 °C.
nuta: Gęstość optyczna kultury przy 600 nm (OD600) powinna wynosić od 0,6 do 0,8.
- Osadzaj bakterie przez odwirowanie przy 6 000 x g przez 2 minuty i ponownie zawieś komórki w 10-30 ml 15% glicerolu w odpowiednim bulionie. Porcję kultury bakteryjnej (500 μl na podwielokrotność) przelać do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Rozmrozić jedną fiolkę z wywarem bakteryjnym w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Osadzać komórki bakteryjne i ponownie zawijać w 500 μl OBB w sterylnych warunkach.
- Przygotować różne rozcieńczenia materiału bakteryjnego w OBB (tj. 10 μl bez rozcieńczenia, 10 μl z 1:10, 10 μl z 1:100 itd.). Wykonać test OPKA (sekcje 4–6, w tym kokultura HL-60/dopełniacza) zgodnie z opisem poniżej, używając różnych rozcieńczeń nieleczonego materiału bakteryjnego. Hodować płytki przez noc w temperaturze 30 °C (bez CO2 ).
nuta: Temperatura 30 °C jest specyficzna dla WU2, aby zapobiec przerostowi; inne szczepy/serotypy mogą rosnąć optymalnie w temperaturze 37 °C.
- Policzyć kolonie dla każdego rozcieńczenia niepoddanego działaniu substancji bakteryjnej hodowanej jednocześnie z komórkami HL-60 i dopełniaczem. Określ, które rozcieńczenie bakterii daje optymalną liczbę policzalnych kolonii (około 80-120 jednostek tworzących kolonie (CFU) dla nieleczonych bakterii współhodowanych z komórkami HL-60). Należy zwrócić uwagę na to rozcieńczenie dla przyszłych OPKA zawierających ten szczep bakteryjny.
4. Leczenie i hodowla bakterii
- Rozmrozić jedną probówkę wywaru bakteryjnego przygotowanego w kroku 3.3. Bakterie w osadach (6 000 x g przez 2 minuty) i ponownie zawiesić osad komórkowy w OBB w optymalnym rozcieńczeniu, jak określono w kroku 3.6.
- Odpipetować 10 μl zawieszonego rozcieńczenia bakteryjnego na basenie na okrągłodennej 96-dołkowej płytce do hodowli komórek.
- Dodać 20 μl odpowiedniego przeciwciała lub leczenia farmakologicznego do każdej studzienki doświadczalnej w dwóch egzemplarzach.
UWAGA: W tym protokole przeciwciało specyficzne dla serotypu wytworzone u myszy jest dodawane jako leczenie X, a enzym hydrolazy glikozydowej, o którym wiadomo, że degraduje kapsułkę polisacharydową serotypu 3, jest dodawany jako leczenie Y (Figura 2). W przypadku studzienek kontrolnych należy użyć 1x PBS lub OBB, w zależności od buforu używanego do studzienek leczniczych.
- Potrząsać płytką z próbką z prędkością około 90 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dostosuj te warunki w zależności od optymalnej temperatury lub warunków wstrząsania testowanych zabiegów.
5. Współkultura bakterii HL-60
- Przygotować komórki HL-60, zbierając zróżnicowane komórki HL-60, które są traktowane DMF trzy dni wcześniej (patrz krok 1.4) do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Osadzać komórki (500 x g, 3 min), wyrzucić supernatant i przemyć co najmniej 10 ml 1x PBS.
- Umyte komórki należy otopić (500 x g, 3 min), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w OBB (zacząć od 1 ml OBB i dostosować do końcowego stężenia 1 x 107/ml po zliczeniu komórek).
- Dodać dopełniacz dla młodego królika (sterylna, nierozcieńczona surowica dla młodego królika, w wieku 3-4 tygodni) w końcowej objętości 1:5.
nuta: Końcowe stężenie mieszaniny HL-60-dopełniacza powinno wynosić 1 x 107/ml. W przypadku badania zależności od dopełniacza można użyć drugiego roztworu zawierającego aktywne komórki HL-60 z inaktywowanym termicznie dopełniaczem (dopełniacz można inaktywować przez inkubację w łaźni wodnej w temperaturze >55 °C przez co najmniej 30 minut).
- Po zakończeniu 1-godzinnej hodowli bakteryjnej (etap 4.4) podzielić każdą próbkę (tj. 10 μl z każdej studzienki o pojemności 30 μl do dwóch nowych studzienek) do zduplikowanych studzienek dla dwóch grup (tj. użyć tylko 20 μl oryginalnej kokultury o pojemności 30 μl, aby uwzględnić błąd pipetowania): jeden zestaw będzie współhodowany z dopełniaczem HL-60, a jeden będzie zawierał tylko bakterie. Dodać 50 μl mieszaniny dopełniacza HL-60 (z kroku 5.3) do każdego zestawu studzienek doświadczalnych (delegowany +HL-60); dodać 50 μl samego OBB do samych studzienek bakterii (delegowane -HL-60).
nuta: W tym przykładzie do początkowej kohodowli z 5 x 10 komórkami HL-60 o pojemności 5/50 μl wykorzystuje się około 800 bakteryjnych CFU. Jeśli ta wielokrotność infekcji jest zbyt wysoka lub zbyt niska, jak wskazują końcowe liczby kolonii, dostosuj początkowe rozcieńczenie bakterii w przeciwieństwie do liczby komórek HL-60.
- Wstrząsać 96-dołkową płytką w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (bez CO2 ).
6. Posiewanie próbek i inkubacja przez noc
- Rozcieńczyć każdą studzienkę w stosunku 1:5 środkiem OBB, tak aby każda próbka miała objętość co najmniej 50 μl.
- Pobrać pipetą 50 μl każdej próbki bezpośrednio na wyznaczony obszar płytki do hodowli bakterii, zapewniając odpowiednie odstępy między próbkami. W przypadku okrągłych płytek agarowych o wymiarach 15 x 100 mmnależy odpipetować około 4 próbek na jedną płytkę.
- Przykryj próbki i pozostaw do wyschnięcia na około 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Odwrócić płytki i kulturę przez noc w temperaturze 30 °C (bez CO2 ). Alternatywnie, płytki hodowlane w słoikach beztlenowych w celu sprawdzenia, czy warunki beztlenowe wpływają na wzrost bakterii lub w celu kontroli morfologii.
- Po całonocnej hodowli należy policzyć kolonie w każdym wyznaczonym obszarze próbki. Analizuj dane, porównując liczbę żywych komórek w każdym zestawie z odpowiednią kontrolą i/lub próbkami, które nie otrzymują kohodowli komórek HL-60 (wskazujące na 100% przeżycia komórek, 0% zabijania komórek).
