Ocena zinternalizowanego Porphyromonas gingivalis w komórkach śródbłonka gospodarza

Streszczenie

Źródło: Wunsch, C. M., et al. Porphyromonas gingivalis jako organizm modelowy do oceny interakcji bakterii beztlenowych z komórkami gospodarza. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie pokazujemy test do oceny przeżywalności Porphyromonas gingivalis w ludzkich komórkach śródbłonka. Miarą przeżywalności i wzrostu zinternalizowanego Porphyromonas gingivalis jest liczba kolonii na płytce agaru z krwią.

Protokół

1. Przetrwanie bakterii zinternalizowanych.

1. Przygotuj bakterie beztlenowe P. gingivalis, aż osiągną średni wzrost (OD₆₆₀ 0,5-0,7).
2. Odwirować bakterie przy 5 000 x g przez 10 minut.
3. Umieścić granulowany P. gingivalis z powrotem w komorze i wyrzucić supernatant. Przemyć PBS i ponownie granulować bakterie przed ponownym wymieszaniem w pożywce VEGF. Przygotować zawiesiny dla wszystkich szczepów bakterii, które mają być badane przy OD₆₆₀ 0,7, co odpowiada środkowej fazie logarytmicznej (~7 x 10,⁸ komórek/ml). Bakterie są teraz gotowe do infekcji.
4. Przenieść 6-dołkowe płytki zawierające HUVEC z inkubatora do hodowli tkankowych do komory beztlenowej. Usuń podłoże i przemyj je trzykrotnie anaerobowym PBS. Dodać 2 ml beztlenowej pożywki VEGF do każdej studzienki i umieścić płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze beztlenowym na 20 minut, aby zrównoważyć temperaturę infekcji.
5. Infekuj komórki gospodarza bakteriami przy wielokrotności infekcji (bakterie MOI: gospodarz) 100:1,
   nuta: Liczba komórek HUVEC jest określana poprzez wykonanie testu wykluczenia trypana na jednym dołku przed zakażeniem. Liczbę komórek bakteryjnych określa się za pomocą gęstości optycznej (np. OD 0,5 = 5 x 10⁸ komórek/ml). Stężenie bakterii jest dostosowywane do prawidłowego MOI na podstawie stężenia HUVEC.
6. Umieścić 6-dołkowe płytki z zakażonymi HUVEC w inkubatorze beztlenowym i pozwolić bakteriom na interakcję z komórkami gospodarza przez 30 minut.
7. Przygotuj saponinę w BHI (1,0% w/v) w komorze beztlenowej i przefiltruj przez filtr 0,2 μm.
8. Wyjąć płytki z inkubatora. Przemyć trzykrotnie beztlenowym PBS i dodać 2 ml pożywki VEGF z dodatkiem antybiotyku (300 μg/ml gentamycyny i 400 μg/ml metronidazolu).
9. Inkubuj przez 1 godzinę. Pamiętaj, aby przetestować antybiotyki, aby były w 100% skuteczne w zabijaniu pożądanego szczepu bakteryjnego i upewnij się, że nie przenikają do komórek gospodarza.
10. Odessać pożywkę, dodać 2 ml przefiltrowanej 1,0% saponiny. Inkubować przez 15 minut, aby umożliwić lizę komórek gospodarza.
11. Zeskrob dno każdej studzienki za pomocą skrobaka do komórek. Zebrać mieszaninę komórek z każdej studzienki i rozcieńczyć w stosunku 1:1 w BHI.
12. Przygotować seryjne rozcieńczenia próbki (1:100, 1:1 000).
13. Umieścić 200 μl pożądanego rozcieńczenia na płytkach z agarem z krwią. Owinąć płytki w parafilm i umieścić je w inkubatorze beztlenowym.
14. Po siedmiu dniach inkubacji w temperaturze 37 °C wyjąć płytki i policzyć jtk.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komora winylowa beztlenowa typu B	Produkty laboratoryjne Coy		Inkubator model 2000
TSA II Tryptykaza Agar sojowy z 5% krwią owczą	Bbl	221261
Pula dawców ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej 10	Technologia LifeLine	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Kompletny zestaw	Technologia LifeLine	LL-0003
TrypKit (Zestaw próbny)	Myśli	LL-0013
Saponina	Riedel-de Haen	Numer katalogowy: 16109
Sól siarczanu gentamycyny	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazol	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M-3761