Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Ekspresja i oczyszczanie przeciwciał
- Utrzymanie komórek jajnika chomika chińskiego (CHO)
- Hoduj komórki CHO w pożywce FreeStyle CHO uzupełnionej dostępnym w handlu 1x suplementem glutaminy w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 130 obr./min z 5%CO2 przy użyciu delongowych kolb Erlenmeyera, szklanych lub jednorazowych.
nuta: Zdecydowanie zaleca się stosowanie kolby z przegrodą z wentylowaną nasadką w celu zwiększenia mieszania i poprawy przenoszenia gazu w warunkach wytrząsania. Znacznie zmniejszoną wydajność przeciwciał uzyskano przy użyciu zwykłych kolb (bez przegród) ze względu na ograniczone mieszanie kultury zawiesinowej.
- Utrzymuj liczbę komórek w zakresie 1-5 x 106 komórek/ml z >95% żywotnością komórek. Jeśli liczba komórek wzrośnie powyżej 5 x 106 komórek/ml, podziel komórki. Nigdy nie pozwól, aby komórki CHO osiągnęły poziom poniżej 0,2 x 106 komórek/ml.
- Transfekcja komórek CHO
- Hoduj komórki CHO w 200 ml pożywki (2 x 106 komórek/ml) w delong Erlenmeyer z przegrodami kolb.
nuta: Kultury zawiesinowe hodowane w kolbach z przegrodami zawsze dawały wyższe plony białka w porównaniu z kulturami hodowanymi w kolbach bez przegrody.
- Do probówki o pojemności 15 ml należy pobrać 5 ml pożywki CHO FreeStyle i dodać 50 μg DNA klonu VH i 75 μg DNA klonu VL. Wiruj, aby dobrze wymieszać.
- Inkubować mieszaninę DNA w temperaturze pokojowej przez 5 min.
nuta: Dłuższa inkubacja zmniejsza wydajność białka.
- Dodać 750 μl 1 mg/ml bulionu z polietylenoiminy (PEI) do roztworu DNA i agresywnie wirować mieszaninę przez 30 s. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 5 minut
nuta: PEI musi być świeży. Wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania PEI znacznie zmniejszają ogólny plon.
- Dodać całą mieszaninę DNA i PEI do komórek, ręcznie potrząsając kolbą. Natychmiast inkubować kolby z przegrodami Erlenmeyera z komórkami w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 130 obr./min.
- Wyrażenie
nuta: Przeciwciało ma wydzielniczy peptyd sygnałowy zmodyfikowany do jego N-końcowego końca, który pomaga w wydzielaniu przeciwciał do pożywki.
- Hodować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 130 obr./min w dniu 1.
- W dniu 2 dodaj 2 ml 100x środka przeciwzbrylającego i 2 ml 100x roztworu przeciwbakteryjnego i przeciwgrzybiczego. Ustawić kolbę na niższą temperaturę (32-34 °C), wytrząsając przy 130 obr./min.
- Co piąty dzień dodawaj 10 ml paszy Tryptone N1 i 2 ml 100-krotnego suplementu glutaminy.
- Kontynuuj liczenie komórek co trzeci dzień za pomocą hemocytometru po zabarwieniu porcji komórek barwieniem błękitem trypanowym. Upewnij się, że żywotność komórek utrzymuje się powyżej 80%.
- W dniu 10 lub 11 należy zebrać pożywkę do oczyszczenia przeciwciał. Wirować kulturę w temperaturze 3000 x g, 4 °C przez 40-60 minut, a następnie przefiltrować przezroczyste podłoże za pomocą filtrów butelkowych 0,22 μM.
- Oczyszczanie
nuta: Oczyszczanie przeciwciał przeprowadza się przy użyciu dostępnej w handlu kolumny Białko-A (patrz tabela materiałów), przy użyciu pompy perystaltycznej.
- Zrównoważyć kolumnę z dwukolumnową objętością buforu wiążącego (20 mM fosforanu sodu o pH 7,4).
- Przepuścić przefiltrowaną pożywkę zawierającą przeciwciało (otrzymane w kroku 1.3.5) przez kolumnę z szybkością przepływu 1 ml/min.
- Umyj kolumnę dwukolumnową objętością buforu wiążącego.
- Eluować przeciwciało do 500 μl frakcji za pomocą 5 ml buforu elucyjnego (30 mM octanu sodu o pH 3,4).
- Zneutralizować pH eluowanego przeciwciała, dodając 10 μl buforu neutralizującego (3 M octan sodu o pH 9) na frakcję.
nuta: Frakcja numer 3-6 zawiera większość przeciwciała. Wskazane jest zachowanie wszystkich frakcji na wypadek, gdyby przeciwciało zostało eluowane w frakcji późniejszej niż oczekiwano.
- Zmierz stężenie oczyszczonych przeciwciał za pomocą spektrofotometru, wybierając domyślny protokół dla immunoglobuliny G (IgG). Końcowe stężenie przeciwciała uzyskuje się w mg/ml, biorąc pod uwagę masę cząsteczkową i współczynnik absorpcji.
2. Etykietowanie fluorescencyjne
UWAGA: Przeciwciała są znakowane barwnikiem podczerwonym, który zawiera grupę reaktywną estrów NHS, która łączy się z białkami i tworzy stabilny koniugat. Ta reakcja jest wrażliwa na pH i działa najlepiej przy pH 8,5. Koniugaty fluorescencyjne znakowane barwnikiem wykazują maksimum absorpcji 774 nm i maksimum emisji 789 nm. pH 8,5 jest kluczem do skutecznej koniugacji.
- Dializować 0,5 ml przeciwciała za pomocą kasety dializacyjnej (0,1-0,5 ml) w 1 l buforu koniugacyjnego (50 mM buforu fosforanowego o pH 8,5). Po 4 godzinach przenieś kasetę dializacyjną do nowego buforu i dializuj przez noc.
- Ustawić reakcję koniugacji, dodając 0,03 mg IRDye 800CW na 1 mg przeciwciała w objętości reakcji 500 μL.
nuta: IRDye 800CW rozpuszcza się w DMSO w stężeniu 10 mg/ml.
- Reakcje etykietowania przeprowadzać przez 2 godziny w temperaturze 20 °C.
nuta: Wydłużenie czasu powyżej 2 godzin nie poprawia etykietowania.
- Oczyść znakowane koniugaty przez intensywną dializę przeciwko 1x PBS.
- Oszacuj stopień znakowania, mierząc absorbancję barwnika przy długości fali 780 nm i absorbancję białka przy długości fali fali 280 nm. Udział barwnika w sygnale 280 nm wynosi 3%.
- Oblicz stosunek barwnika do białka za pomocą tego wzoru:
gdzie 0,03 jest współczynnikiem korygującym absorbancję barwnika użytego przy długości fali 280 nm (równym 3,0 % jego absorbancji przy długości fali fali 780 nm), εDye i εProtein są współczynnikami ekstynkcji molowej odpowiednio dla barwnika i białka (przeciwciała).
UWAGA: εBarwnik wynosi 270 000 M-1 cm-1, a εBiałko wynosi 203 000 M-1 cm-1 (dla typowej IgG) w mieszaninie 1:1 PBS: metanol. Białka inne niż IgG mogą mieć bardzo różne współczynniki ekstynkcji molowej. Zastosowanie prawidłowego współczynnika ekstynkcji dla białka będącego przedmiotem zainteresowania ma zasadnicze znaczenie dla dokładnego określenia stosunku D/P.
- Oblicz końcowe stężenie białka, korzystając z tego wzoru:
nuta: Zawsze potwierdzaj skuteczność wiązania antygenu znakowanych i nieznakowanych przeciwciał za pomocą testu ELISA (test immunoenzymatycznego) lub cytometrii przepływowej przed przystąpieniem do badań in vivo.
3. Badania ksenoprzeszczepów myszy
- Przygotowanie komórek nowotworowych do wstrzyknięcia
- Hoduj komórki OVCAR-3 w pożywce RPMI-1640, uzupełnionej 10% FBS i 1x penicyliną-streptomycyną.
- Dzień przed wstrzyknięciem subkulturować komórki w nowych szalkach hodowlanych o średnicy 100 mm z 10 ml kompletnej pożywki/szalkę. Użyj numeru komórki 0,5-1 x 106 komórek / naczynie.
- Inkubować kultury w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 przez 20-24 godziny.
- W dniu wstrzyknięcia należy usunąć pożywkę wzrostową z szalek hodowlanych. Dokładnie spłucz warstwę komórkową solą fizjologiczną Dulbecco wolną od Ca2 + / Mg2 + w celu usunięcia martwych komórek, resztek komórkowych i wszelkich śladów surowicy, które mogą zakłócać działanie trypsyny.
- Trypsynizuj komórki, dodając 1,0-1,5 ml roztworu trypsyny-EDTA do każdego naczynia i spróbuj rozprowadzić roztwór, przechylając naczynie dookoła, a następnie inkubując w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut
nuta: Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem, aby sprawdzić rzeczywisty stan trypsynizacji. Niedostateczna trypsynizacja powoduje mniejszą liczbę komórek odłączających się od powierzchni szalki hodowlanej, nadmierna trypsyna wywołuje stres komórkowy. Dlatego ważna jest właściwa trypsynizacja.
- Dodaj 1,0-1,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej do każdej płytki, aby zatrzymać działanie trypsyny, a następnie ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując.
nuta: Delikatne pipetowanie jest ważne dla utrzymania zdrowia komórek.
- Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Zebrać osad komórkowy po usunięciu supernatantu i umyć ogniwa, ponownie zawieszając osad w 1x DPBS.
- Wirować zawiesinę komórek z niską prędkością 250 x g przez 5 minut.
- Dodać 500 μl DPBS i ponownie zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
nuta: Aby uzyskać lepszą dokładność, powtórz liczenie trzy razy i weź średnią.
- Dostosuj objętość w taki sposób, aby końcowa gęstość komórek wynosiła 1 x 108 komórek/ml.
- Podskórne wstrzykiwanie komórek w celu wytworzenia ksenoprzeszczepów myszy
nuta: Wszystkie procedury powinny być wykonywane w szafie bezpieczeństwa BSL2. W niniejszym badaniu wykorzystano myszy Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+.
- Pobrać 50 μl zawiesiny komórek do probówki o pojemności 1,5 ml i wymieszać z 50 μl podłoża z matrycą błony podstawnej.
nuta: Pożywka z matrycą błony podstawnej ma tendencję do tworzenia stanu podobnego do żelu w temperaturze pokojowej, dlatego ostrożnie utrzymuj komórki i mieszaninę podłoża matrycowego na lodzie. Zaleca się przechowywanie probówek, końcówek i strzykawek w lodówce, a następnie przeniesienie ich na lód przed wstrzyknięciem zwierzęcia.
- Mieszaj mieszaninę, aby uniknąć zbrylania się komórek. Następnie weź te 100 μl mieszaniny zawiesiny komórkowej i matrycy, która zawiera 5 x 106 komórek, do strzykawki o pojemności 1 cm3.
- Delikatnie unieść skórę zwierzęcia, aby oddzielić skórę od leżącej pod nią warstwy mięśniowej i powoli wstrzyknąć zawiesinę komórkową (100 μl) pod skórę (5 x 106 komórek) za pomocą igły 26 G. Odczekaj kilka sekund przed wyjęciem igły, aby podłoże z macierzy podstawowej mogło utworzyć półstałą strukturę przypominającą żel wraz z komórkami pod skórą, zapobiegając wydostawaniu się mieszaniny z miejsca wstrzyknięcia.
nuta: Komórki muszą zostać przetestowane przed wstrzyknięciem pod kątem wszelkich zanieczyszczeń, które mogą zaszkodzić myszom z niedoborem odporności. Podczas wstrzykiwania nie należy wkładać igły zbyt głęboko w skórę, ponieważ może to spowodować powstanie guza głębszego niż oczekiwano.
- Trzymaj zwierzę w sterylnej klatce i obserwuj przez około 20 minut.
- Obserwuj myszy przez 2-3 tygodnie i pozwól guzowi urosnąć do 500 mm3 wielkości.
4. Lokalizacja przeciwciał za pomocą systemu obrazowania in vivo
UWAGA: Sprzęt do obrazowania in vivo (patrz Tabela materiałów) użyty w tym eksperymencie wykorzystuje zestaw wysokowydajnych filtrów i algorytmów demiksowania widmowego do nieinwazyjnej wizualizacji i śledzenia aktywności komórkowej i genetycznej w żywym organizmie w czasie rzeczywistym. System zapewnia możliwość monitorowania zarówno fluorescencji, jak i bioluminescencji.
- Wstrzyknąć 25 μg przeciwciała znakowanego barwnikiem przez żyłę ogonową.
- Znieczulenie myszy z nowotworem za pomocą 2% izofluranu. Sprawdź, czy nie ma reakcji na odruchy pedałowania.
- Gdy myszy przestaną się poruszać, rozszerz boczną żyłę ogonową, stosując wodę z robaków.
- Wstrzyknąć 25 μg (w 100 μl) znakowanego przeciwciała za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 26 G.
- Podobnie, jako kontrola ujemna, znakuj i wstrzyknij niespecyficzne przeciwciało izotypu IgG1, które nie jest skierowane przeciwko komórkom nowotworowym.
- Wykonaj obrazowanie na żywo in vivo po 8, 24, 48 godzinach itd. wstrzyknięć przeciwciał.
- W powiązanym oprogramowaniu kliknij przycisk Inicjalizuj znajdujący się na panelu sterowania i upewnij się, że stage temperatura wynosi 37 °C.
- Włącz dopływ tlenu, wszystkie pompy w układzie anestezjologicznym oraz dopływ gazu izofluranowego do komory anestezjologicznej i ustaw zawór parownika izofluranu na 2%.
- Przenieś myszy do komory anestezjologicznej i poczekaj, aż myszy zostaną całkowicie znieczulone. Nałóż maść nawilżającą do oczu, aby uniknąć wysuszenia oczu.
- Przejdź do Panelu sterowania, skonfiguruj obrazowanie fluorescencyjne za pomocą opcji Kreator obrazowania i wybierz wzbudzenie przy 773 nm i emisję przy 792 nm.
nuta: Domyślne ustawienia automatycznej ekspozycji zapewniają dobry obraz fluorescencyjny. Jednak preferencje automatycznej ekspozycji można modyfikować zgodnie z potrzebami.
- Przenieś znieczulone myszy do komory obrazowania i złóż je na polu obrazowania za pomocą stożka nosowego. Etap obrazowania daje możliwość zakwaterowania 5 myszy jednocześnie.
nuta: Zobrazuj myszy kontrolne wraz z myszami testowymi, aby mieć podobną ekspozycję i inne ustawienia podczas analizy.
- Gdy wszystko będzie gotowe, wybierz opcję Zdobądź na panelu sterowania, aby uzyskać obraz.
- Dzięki ustawieniom automatycznej ekspozycji system generuje obraz w ciągu minuty. Wygenerowany obraz to nałożenie fluorescencji na obraz fotograficzny o natężeniu fluorescencji optycznej wyrażonej w jednostkach zliczeń lub fotonów lub pod względem wydajności.
- Po uzyskaniu obrazu przenieś myszy z komory obrazowania z powrotem do klatki i obserwuj ich powrót do zdrowia przez 1 do 2 minut.
- Dostosuj obraz jeszcze bardziej za pomocą narzędzi i funkcji dostępnych w oprogramowaniu do analizy obrazu. Narzędzia do analizy obrazu znajdują się na pasku menu i palecie narzędzi.
- W obszarze Image Adjustment (Dopasowywanie obrazu) dostosuj jasność, kontrast lub krycie, a następnie wybierz skalę kolorów.
- Użyj narzędzi ROI, aby określić obszar zainteresowania (ROI) na obrazie optycznym i zmierzyć intensywność sygnału w ramach ROI. W razie potrzeby wyeksportuj ilościowe dane sygnału do arkusza kalkulacyjnego i wykreśl dane.
- W przypadku badań kontrolnych należy przeanalizować sekcje zwłok różnych tkanek (np. wątroby, płuc, serca, nerek, śledziony, mózgu itp.) obok siebie, aby uzyskać szczegółowy, niespecyficzny rozkład przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie.
nuta: Dane można dodatkowo potwierdzić za pomocą swoistego tkankowo testu ELISA, wykorzystując antygen (w tym przypadku FOLR1) w 96 testach dołków.
