$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Barwienie metodą cytometrii przepływowej komórek pochodzących z monocytów zakażonych Mtb
UWAGA: Następujące kroki muszą być wykonane w obiekcie BSL-3. Barwienie cytometrią przepływową można wykonać na 96-dołkowej płytce zamiast w probówkach.
- Odłączyć Mycobacterium tuberculosis, komórki zakażone Mtb (i niezakażone grupy kontrolne) od studzienek na płytce (płytkach) 6-dołkowej przez inkubację z 1 ml buforu FACS na studzienkę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Delikatnie pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są odłączone. Jeśli to możliwe, potwierdź odłączenie komórek za pomocą mikroskopii. Przenieść zawiesinę komórek z każdej studzienki do zakręcanej probówki do mikrowirówki i obracać probówki o masie 200 x g przez 5 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie.
- Przemyć osad komórek w każdej probówce dwukrotnie buforem FACS i wirować komórki pod ciśnieniem 200 x g przez 5 minut.
- Wybarwić komórki (około 0,5 x 106 do 1 x 106 komórek / probówkę) około 50 μl koktajlu przeciwciał antyludzkich sprzężonych z fluorochromem, w tym TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tabela 1) w połączeniu z barwnikiem żywotności Zombie-UV przez 30 minut w 4 °C (lodówka) w ciemności.
- Przepłukać wybarwione komórki dwukrotnie 400 μl buforu FACS i wirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut.
- Utrwalić wybarwione komórki za pomocą 200 μl buforu utrwalającego (świeżo przygotowanego) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, aby zapewnić całkowitą inaktywację prątków.
- Przemyć komórki dwukrotnie 400 μl buforu FACS i wirować w temperaturze 200 x g przez 5 minut, aby usunąć nadmiar buforu utrwalającego.
- Ponownie zawiesić utrwalone komórki w 400 μl buforu FACS i przenieść próbki do nowych probówek mikrowirówek o pojemności 1 ml przed wyjęciem ich z laboratorium BSL-3 do cytometrii przepływowej w BSL-2. Wybarwione komórki przechowywać w temperaturze +4 °C do momentu pobrania próbki.
nuta: Spryskaj probówki 70% etanolem przed wyjęciem ich z laboratorium BSL-3. Formaldehyd jest toksyczny (rakotwórczy) i musi być przechowywany w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Wyrzuć odpady formaldehydu do oddzielnych odpadów chemicznych.
2. Akwizycja i analiza danych cytometrycznych przepływowych komórek pochodzących z monocytów zakażonych Mtb
UWAGA: Kroki 2.1–2.2 powinny być wykonane przed opisanym powyżej barwieniem cytometrią przepływową. Aby uniknąć problemów z zlepianiem się komórek i dysocjacją barwników tandemowych po utrwaleniu komórek, pobieranie próbek zarówno komórek zakażonych Mtb, jak i niezakażonych przeprowadza się w ciągu 4-10 godzin po barwieniu przeciwciał pierwotnych.
- Przed opisanym powyżej barwieniem cytometrią przepływową należy skompensować sygnał fluorescencyjny dla każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem wymienionego w panelu barwienia (Tabela 1) za pomocą kulek kompensacyjnych (zarówno dodatnich, jak i ujemnych).
- Miareczkować rozcieńczenie przeciwciał do barwienia ludzkich makrofagów, aby uzyskać optymalny sygnał dla każdego fluorochromu.
- Użyj niebarwionych komórek, aby określić poziom fluorescencji tła niezbędny do ustawienia bramki dla ujemnej populacji komórek, co pozwala na wizualizację barwionych komórek (makrofagi są wysoce autofluorescencyjne).
- Pobrać co najmniej 50 000 komórek/próbkę w cytometrze przepływowym przy użyciu zalecanego oprogramowania do pozyskiwania danych.
- Eksport plików akwizycji z cytometru przepływowego w formacie standardowej cytometrii przepływowej (FCS) 3.1.
- Analizuj pliki FCS w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej.
- Makrofagi bramkują zgodnie z ich charakterystyką rozpraszania do przodu i boku (FSC i SSC) i wykluczają martwe komórki przez bramkowanie żywych/martwych komórek przy użyciu barwnika żywotności Zombie-UV.
- Wizualizacja makrofagów zakażonych H37Rv-GFP w kanale FITC.
- Określ częstość występowania dodatnio barwionych komórek i średnią geometryczną intensywności fluorescencji (MFI) dla wszystkich markerów (Tabela 1).
Tabela 1: Lista przeciwciał stosowanych w cytometrii przepływowej.
SZT.
powiedział:
powiedział:
SZT.
TGL
TGL
powiedział:
TGL
Zobacz materiał
)
TGL
Zobacz materiał
TGL
powiedział:
TGL
TGL
JEZDNYCH
| laser | filtr | Fluorochrom | Fenotyp | funkcja | klon | Nr katalogowy | firma |
| 639 | nr kat. 670/30 | AF647 | TLR2 | Receptor rozpoznawania patogenów | TL2.1 | 309714 | Legenda biologiczna |
| 639 | 780/60 | APC-CY7 | Płyta CD206 | Receptor mannozy | 15-2 | 321120 | Legenda biologiczna |
| Rejon 405 | nr kat. 610/20 | Zobacz materiał BV605 | Płyta CD163 | Receptor zmiatacza | GHI/61 | 333616 | Legenda biologiczna |
| Rejon 405 | nr kat. 670/30 | Zobacz materiał BV650 | Płyta CD80 | Cząsteczka kostymulująca | 2K10 | 305227 | Legenda biologiczna |
| Rejon 405 | 710/50 | Zobacz materiał BV711 | CCR7 (Klasa przemysłowa | Receptor chemokiny | Zobacz materiał G043H7 | 353228 | Legenda biologiczna |
| Rejon 405 | 780/60 | Zobacz materiał BV785 | Płyta CD86 | Cząsteczka kostymulująca | Informatyka 2.2 | 305442 | Legenda biologiczna |
| Z numerem 488 | 530/30 | Dobra praktyka rolna | Mtb | Bakterie wewnątrzkomórkowe | | | |
| Okręg wyborczy 561 | 586/15 | Pe | Płyta CD200R | Receptor hamujący | OX-108 | 329306 | Legenda biologiczna |
| Okręg wyborczy 561 | nr kat. 620/14 | PE/OLŚNIENIE 594 | Płyta CD64 | Receptor Fc gamma-I IgG | Rozdział 10.1 | 305032 | Legenda biologiczna |
| Okręg wyborczy 561 | nr kat. 661/20 | PE-CY5 (PC5) | HLA-DR | Cząsteczka MHC klasy II | Zobacz materiał L243 | 307608 | Legenda biologiczna |
| Okręg wyborczy 355 | Nr kat. 450/50 | Zobacz materiał BUV395 | Barwnik żywotności | Marker żywej/martwej komórki | Zombie UV | 423108 | Invitrogen |