$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Przygotowanie odczynnika
- Przygotuj roztwór podstawowy pożywki hodowlanej do pobrania całych tkanek: 1 l zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 110 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 11 ml penicyliny-streptomycyny (stężenie końcowe 1%) i 1,1 ml insuliny sterylizowanej filtrem (stężenie końcowe 0,1%). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
- Przygotuj bufor chelatujący #1: 30 ml pożywki hodowlanej (zgodnie z opisem w 1.1), 600 μl 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (końcowe stężenie 10 mM), 300 μl gentamycyny (stężenie końcowe 1%) i 60 μl amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
- Przygotuj bufor chelatujący #2: 30 ml pożywki hodowlanej (zgodnie z opisem w 1.1), 300 μl 0,5 M EDTA (stężenie końcowe 5 mM), 300 μl gentamycyny (stężenie końcowe 1%) i 60 μl amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
- Przygotowanie pożywki dla ludzkich minijelit: 41,4 ml DMEM/F-12, 5 ml FBS (końcowe 10%), 500 μL penicyliny-streptomycyny (końcowe stężenie 1%), 500 μL L-glutaminy (końcowe stężenie 1%), 500 μL gentamycyny (końcowe stężenie 1%), 100 μL amfoterycyny B (końcowe stężenie 0,2%), 500 μL 1 M kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowego (HEPES) (stężenie końcowe 10 mM), 500 μl 100x suplementu N-2 i 1 ml 50x suplementu B-27 minus witamina A, co daje całkowitą objętość 50 ml. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C.
- Przygotowanie kompletnego ludzkiego podłoża dla minijelitów: 10 ml ludzkiego podłoża dla minijelita (przygotowanego w 1.4), 10 μl 100 μg/ml Wnt3a (stężenie końcowe 100 ng/mL), 10 μl 100 μg/ml Noggin (stężenie końcowe 100 ng/mL), 10 μL 1 mg/ml R-Spondyny (stężenie końcowe 1 μg/mL), 10 μL 500 μg/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) (stężenie końcowe 50 ng/ml), 10 μL 1 M N-acetylocysteiny (stężenie końcowe 1 mM), 10 μL 10 mM Y-27632 (stężenie końcowe 10 μM), 10 μL 500 μM A-83 (stężenie końcowe 500 nM), 10 μL 10 mM SB202190 (stężenie końcowe 10 μM), 100 μl 1 M nikotynamidu (stężenie końcowe 10 mM) i 1 μl 100 μM [leu] 15-gastryna 1 (stężenie końcowe 10 nM). Całkowita objętość 10 ml. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
nuta: Roztwory należy zużyć w ciągu 48 godzin.
2. Izolacja krypty i poszycie z całej tkanki
- W momencie pobierania na salę operacyjną należy umieścić próbkę ludzkiej tkanki jelita cienkiego w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Umyj próbkę w zimnym DPBS, aż będzie wolna od stolca i krwi. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C w pożywce RPMI 1640 do czasu, aż będzie gotowa do izolacji krypty.
nuta: Tkanka nie może być przechowywana dłużej niż 24 godziny.
- Upewnij się, że próbka jest wolna od stolca i krwi. Za pomocą delikatnych nożyczek preparacyjnych usuń nadmiar tłuszczu lub klipsy/zszywki chirurgiczne itp. Zważyć próbkę.
UWAGA: Celuj w kawałek o wadze około 0,75-2,5 g.
- Pokrój próbkę na kawałki o długości 0,5 cm i umieść w 30 ml buforu chelatującego #1 (przygotowanego w kroku 1.2).
- Wstrząsać na niskich obrotach przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Przefiltruj tkankę przez sitko komórkowe 100 μm i przeprowadź przez nie przepływ odrzutów.
- Dodaj tkankę do 30 ml buforu chelatującego #2 (przygotowanego w kroku 1.3).
- Wstrząsać na niskich obrotach przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Przefiltruj tkankę przez sitko o średnicy 100 μm i przepuść przez nie odrzut
.
- Rozmrozić 500 ml matrycy błony podstawnej na lodzie do użycia w kroku 2.8.
- Dodaj chusteczkę do 10 ml zimnego DMEM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i energicznie wstrząsaj ręcznie przez 10 s.
- Przefiltruj przez sitko o wielkości 100 μm i zbierz przez nie przepływ (etykieta #1). Trzymaj rurkę #1 na lodzie.
- Dodaj tkankę do kolejnych 10 ml zimnego DMEM w osobnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i energicznie wstrząsaj ręcznie przez 10 sekund.
- Przefiltruj przez sitko o wielkości 100 μm i zbierz przez nie (etykieta #2).
- Powtórz jeszcze dwa razy, aż pojawią się cztery stożkowe rurki z przepływem (oznaczone rurki #1-4).
- Przefiltruj roztwór probówki #1 przez sitko o pojemności 100 μm i przenieś przepływ do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (etykieta #1). Powtórz dla #2-4.
- Odwirować 15 ml probówki #1-4 przy 200 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- W okapie z przepływem laminarnym usuń supernatant z probówek #1-4 i wyrzuć. Należy unikać rozerwania chmury tkanki znajdującej się bezpośrednio nad osadem, nawet jeśli oznacza to pozostawienie części supernatantu.
- Pipetując powoli, wymieszać granulki z pozostałościami supernatantu w probówkach #1-4.
- Przenieś mieszaninę z probówek #1-4 do jednej stożkowej probówki o pojemności 2 ml.
- Odwirować stożkową probówkę o masie 200 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl matrycy membrany podstawnej.
nuta: Utrzymuj matrycę błony podstawnej na lodzie przez cały czas i szybko pracuj nad kolejnymi krokami. Produkt ten bardzo szybko polimeryzuje w temperaturze pokojowej.
- Nanieść 50 μl zawiesiny matrycy próbki/błony podstawnej na środek studzienki w płytce 24-dołkowej. Powinno to wyglądać w kształcie kopuły.
nuta: Zastosowanie schłodzonych końcówek pipet pomaga w płynniejszym przenoszeniu zawiesiny, minimalizując polimeryzację.
- Powtórz 9 razy, aby napełnić łącznie 10 dołków.
- Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację.
- Dodać 500 μl Human Minigut Media Complete (przygotowanego w kroku 1.5) do każdej studzienki. Wymieniaj co 2 dni.
- Zbierz enteroidy po 5-10 dniach, gdy uwidoczni się pączkowanie. Zobacz kroki 4 i 5, aby uzyskać instrukcje dotyczące zbierania.
3. Indukcja eksperymentalnego NEC
- Dodać 10 μl 5 mg/ml lipopolisacharydu (LPS) do 500 μl Human Minigut Media Complete (przygotowanego w kroku 1.5) do każdej studzienki w dniu 0. Wymieniaj co 2 dni aż do odbioru.