Test adhezji in vitro w celu wykrycia przylegania komórek rakowych do zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych

W tym artykule

Streszczenie

Najmeh, S., et al. Uproszczona izolacja i obsługa ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych (NET). J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie demonstrujemy test wykorzystujący mikroskopię fluorescencyjną do wykrywania adhezji komórek rakowych do pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). W studzienkach testowych obserwuje się znaczny wzrost liczby znakowanych fluorescencyjnie komórek rakowych przylegających do NET, podczas gdy studzienki potraktowane DNazą wykazują zmniejszoną adhezję komórek rakowych do NET.

Protokół

1. Test adhezji statycznej komórek rakowych NET.

Dodać 100 μl wcześniej otrzymanego materiału NET na studzienkę do 96-dołkowej płaskiej płytki dennej i pozostawić do pokrycia studzienek O/N w temperaturze 4 °C w ciemności.
Między 12 a 20 godzinami później sprawdź, czy na dnie studzienek pod mikroskopem tworzy się jednolita monowarstwa bezkomórkowych NET (ryc. 1). W tym momencie delikatnie zassaj cały nieprzylegający materiał z dołków, uważając, aby nie naruszyć monowarstwy NET na dole.
Dodać 100 μl 1% roztworu blokującego albuminę surowicy bydlęcej (BSA) do każdej studzienki i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
Odłącz komórki rakowe A549 od kolby T-75 za pomocą 2 ml 0,25% roztworu trypsyny. Po odłączeniu dodać 10 ml pożywki A549 do trypsynizowanych komórek i odwirować w temperaturze 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce, aby uzyskać stężenie 2 x10⁴komórek nowotworowych na 100 μl pożywki.
nuta: Komórki A549 hodowano oddzielnie. Krótko mówiąc, komórki hodowano i utrzymywano w pożywkach DMEM F12 zawierających 10% FBS i 1% penicyliny Streptomycyny i inkubowano w temperaturze 37 °C 5% CO₂ . Po osiągnięciu 70 - 80% konfluencji komórek, zostały one odłączone za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i ponownie zawieszone w tym samym pożywce, które opisano powyżej.
Wybarwić komórki rakowe za pomocą CFSE, dodając 1 μl CFSE na ml pożywki i pozostawiając do barwienia w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po barwieniu odwirować w temperaturze 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w początkowej objętości pożywki, aby uzyskać stężenie 2 x10⁴ komórek nowotworowych na 100 μl pożywki.
Po 1 godzinie blokowania NETs delikatnie odessać roztwór blokujący i dodać 2 x10⁴komórki rakowe w pożywce, co odpowiada 100 μl, na basenie nad monowarstwą NET i pozostawić na 90 minut w temperaturze 37 °C 5% CO₂ . Delikatnie odessać komórki i dodać 100 μl PBS do każdej studzienki, aby umyć wszelkie nieprzylegające komórki.
W niektórych studzienkach dodaj 1000U DNAzy I na studzienkę przez 10 minut przed myciem, aby zdegradować NET. Będzie to służyć jako kontrola negatywna. W innych studzienkach dodaj 100 μl sterylnej wody na studzienkę przez 10 minut, która posłuży jako kontrola pojazdu (VC).
UWAGA: Zwykle wykonuje się 3 powtórzenia na warunek w celu zwiększenia wielkości próby.
Odessać i wyrzucić wszystkie roztwory ze studzienek, pozostawiając na dnie tylko NET i przylegające komórki rakowe. Dodaj 100 μl 4% roztworu formaldehydu na studzienkę, aby przymocować przylegające komórki rakowe do NETS i odczytać test pod mikroskopem fluorescencyjnym (ryc. 1). Wykreśl i przeanalizuj wyniki (Rysunek 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1. Monowarstwa NETTO. Obrazy z mikroskopii świetlnej 96-dołkowych studzienek płytkowych pokrytych NET pokazują (A) jednolitą monowarstwę NET w całej studzience, w przeciwieństwie do (B) niewystarczającego pokrycia studzienki przerwaną warstwą NET. Podziałka skali wynosi 40 μm.