Barwienie komórek bakteryjnych i przygotowanie do badań immunologicznych

Streszczenie

Źródło: Yang, J. et al., Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza.J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje barwienie i przygotowanie komórek bakteryjnych do badań immunologicznych przy użyciu czerwonego barwnika fluorescencyjnego. Barwione bakterie są rozcieńczane i ponownie zawieszane w pożywce wzrostowej, aby osiągnąć pożądane stężenie bakterii do infekcji komórek gospodarza, reprezentujące wielość infekcji.

Protokół

1. Rozwój i barwienie bakterii

1. Wykonuj wszystkie prace bakteryjne w komorze bezpieczeństwa biologicznego, laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
2. Zaszczepić wszystkie kultury bakterii, w tym Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis itp., z zamrożonego bulionu glicerolowego i hodować je w tryptycznym bulionie sojowym (TSB, 3 ml) w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc utrzymywanej przy prędkości 250 obr./min.
3. Następnego dnia użyj rozcieńczenia 1:100 kultury przez noc, aby zaszczepić subkulturę i hodować ją w TSB (1 ml) przez 3 godziny do fazy wykładniczej, zmierzyć gęstość optyczną, OD przy 600 nm (OD₆₀₀), aby potwierdzić. Upewnij się, że OD₆₀₀ mieści się w zakresie 0,4-0,6.
4. Przed wykonaniem testu przylegania bakterii do gospodarza, należy rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną na płytkach agarowych TSB, inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C, a następnie ustalić jednostki tworzące kolonie bakteryjne, CFU na podstawie liczby kolonii. Dla P. aeruginosa OD₆₀₀ 1,0 odpowiada 2 x 10⁸ żywotnym komórkom bakteryjnym/ml, a dla L. monocytogenes OD₆₀₀ 1,0 odpowiada 9 x 10⁸ żywotnych komórek bakteryjnych/ml.
5. Zbierz kultury bakterii w fazie wykładniczej przez odwirowanie przy 13 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT), a następnie umyj je raz za pomocą 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS 1 ml). Zawiesić granulki bakteryjne w 1 ml 1x PBS i oznaczyć stężenia, mierząc OD₆₀₀ zawiesin bakteryjnych. Na przykład P. aeruginosa z OD₆₀₀ 0,5 reprezentuje stężenie 1 x 10⁸ komórek bakteryjnych/ml.
6. Zawiesinę bakteryjną należy zabarwić zielonym lub czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie obracając w ciemności. W tym celu dodaj 2 μl 500-krotnie skoncentrowanego barwnika barwiącego do 1 ml zawiesiny bakteryjnej, aby rozcieńczyć barwnik 1-krotnie. Aby zmyć barwnik barwiący, odwirować zabarwione bakterie przy 13 000 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1x PBS trzy razy.
   nuta: Jeśli w eksperymencie używane są bakterie oznaczone fluorescencją (zielone białko fluorescencyjne (GFP-), czerwone białko fluorescencyjne (RFP-), mCherry itp.), pomiń ten etap barwienia bakteryjnego. W protokole tym zastosowano P. aeruginosa znakowane GFP i L. monocytogenes barwione barwnikiem czerwonym fluorescencyjnie.
7. Zebrać barwione komórki bakteryjne lub bakterie znakowane GFP przez odwirowanie przy 13 000 x g przez 2 minuty. Zawiesić w świeżej pożywce F-12K (1 ml) i zmierzyć OD₆₀₀ w każdej kulturze. Następnie rozcieńczyć kultury do pożądanych stężeń w oparciu o wielokrotność infekcji (MOI) i stężenie komórek gospodarza. Końcowa objętość użyta w tym eksperymencie to 500 μL.
   nuta: Na przykład, jeśli stężenie komórek gospodarza zliczone za pomocą barwienia błękitem trypanowym wynosi 1 x 10⁵ komórek/ml, pożądane stężenie komórek bakteryjnych przy MOI 100 wyniesie 1 x 10⁷ komórek/ml. Stężenie P. aeruginosa przy 0,5 OD₆₀₀ wynosi 1 x 10⁸/mL. Aby uzyskać pożądane stężenie, należy rozcieńczyć kulturę P. aeruginosa 10-krotnie i dodać 50 μl ponownie zawieszonej kultury do 450 μl świeżej pożywki F-12K.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 kanałów PBS	Firma VWR	Numer katalogowy: 45001-130
BactoView na żywo czerwony	Biot	Numer katalogowy: 40101	Barwnik zwalczający bakterie
wirówka	Eppendorf	Zobacz materiał 5810R
Bakteria E. coli			Zapas laboratoryjny
F-12k średni	Kontroler ATCC (Kontroler T	302004	Pożywka do hodowli komórkowych A549
Surowica bydlęca płodu	Corning	35-016-CV
L. monocytogenes			Kolekcje NIST
Fotometr OD600 DiluFotometr	NIEMOC
P. aeruginosa (P. aeruginosa)			Zapasy laboratoryjne dr Lori Burrows
P. aeruginosa ΔpilA			Zapasy laboratoryjne dr Lori Burrows
S. agalactiae (S. agalactiae)			Kolekcje NIST
S. aureus (złocist)	BEI (Biało-Wschodnia	NR-46543 (Zobacz materiał NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI (Biało-Wschodnia	NR-48164 (wersja angielska)
S. rubidaea (S. rubidaea)			Kolekcje NIST
Typowy bulion sojowy	Growcells (Komórki do uprawy	MBPE-4040 (wersja angielska)