Wykrywanie wiązania witronektyny z powierzchniami bakteryjnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Abstract

Źródło: Singh, B. et al., Testy do badania roli witronektyny w adhezji bakteryjnej i odporności surowicy.J. Vis. Exp.(2018)

Ten film pokazuje wykrywanie interakcji witronektyny z białkami powierzchniowymi bakterii. Analiza cytometrii przepływowej mierzy sygnał fluorescencyjny znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał związanych z witronektyną, potwierdzając jej obecność na powierzchni bakterii. Technika ta zapewnia wgląd w interakcje gospodarz-patogen i potencjalne terapie infekcji bakteryjnych.

Protocol

1. Analiza witronektyny, Vn jako bakteryjnego białka-liganda powierzchniowego

1. Wykrywanie wiązania Vn na powierzchni bakterii za pomocą cytometrii przepływowej
   nuta: W cytometrii przepływowej użyliśmy rozpraszania bocznego i rozproszenia do przodu do bramowania zdarzeń dodatnich. W celu zbadania interakcji z Vn, Haemophilus influenzae typu f, wybrano izolaty kliniczne Hif (n = 10) wraz z E. coli BL21 (DE3) jako kontrolę ujemną (Figura 1A).
   1. Kultura Hif izoluje klinicznie w pożywce do infuzji mózgowo-sercowej (BHI) uzupełnionej 10 μg/ml dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD) i heminy w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Użyj pożywki Luria-Bertani do hodowli E. coli. Zebrać Hif w połowie fazy logarytmicznej (gęstość optyczna, OD₆₀₀ = 0,3) i ponownie zawiesić bakterie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,2, zawierającej 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (bufor blokujący; PBS-BSA). Dostosuj zawiesinę do 10⁹ jednostek tworzących kolonie, jtk/ml.
   2. Przenieść podwielokrotności zawierające 5 x 10⁶ CFU do probówek okrągłodennych z polistyrenu o pojemności 5 ml (12 x 75 mm²) i dodać 1 ml buforu blokującego. Odwirować zawiesinę o stężeniu 3 500 × g w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut w celu osadzenia bakterii, a następnie ostrożnie zassać, aby usunąć supernatant bez naruszania osadu.
   3. Zawiesić osady bakteryjne w 50 μl buforu blokującego zawierającego 250 nM Vn i inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Po inkubacji osadzać bakterie przez odwirowywanie przy 3,500 x g przez 5 minut, a następnie umyć granulki trzykrotnie za pomocą PBS i podobnych etapów wirowania.
   4. Do osadu bakteryjnego dodać 50 μl pierwotnych owczych przeciwciał poliklonalnych przeciwko ludzkiemu Vn (pAbs) w rozcieńczeniu 1:100 w PBS-BSA. Inkubować zawiesinę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie przemyć bakterie PBS w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał (jak opisano w kroku 1.1.3).
   5. Następnie dodać 50 μl PBS-BSA zawierającego sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) pAb przeciwko owcom osła (rozcieńczenie 1:100) i inkubować w temperaturze suchej atk przez 1 godzinę w ciemności.
   6. Przygotować ślepą próbę kontrolną poprzez inkubację bakterii z samym buforem blokującym i pAb bez Vn.
   7. Przemyć bakterie trzykrotnie 1 ml buforu blokującego i osadzić zawiesinę przez odwirowanie, jak opisano w ppkt 1.1.2. Na koniec ponownie zawiesić osad bakteryjny z 300 μl PBS i przeanalizować go za pomocą cytometrii przepływowej.

Results

Rycina 1: Haemophilus influenzae serotyp f wiąże Vn poprzez PH wyrażane powierzchniowo.(A) Wyniki cytometrii przepływowej wskazujące na wiązanie Vn z komórkami izolatów klinicznych Hif. Każdy izolat kliniczny (5 x 10⁶ CFU) inkubowano z 250 nM ludzkim Vn. Związany ligand wykryto przy użyciu owczych przeciwciał anty-Vn pAb i sprzężonych z FITC drug...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ml probówka okrągłodenna z polistyrenu	BD Sokół	Nr kat. 60819-138	12 × styl 75 mm
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	Certyfikat A2058	Nadaje się do hodowli komórkowych
Cytometr przepływowy	BD Nauki biologiczne	651154	Klasa analizy komórek do zastosowań badawczych
Witronektyna (Vn) z osocza ludzkiego	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Klasa hodowli komórkowej
Żywiciel E. coli (E. Coli BL21)	Novagen	Numer katalogowy: 69450-3	Gospodarz wyrażający białko
Przeciwciała przeciwko owcom skoniugowane z FITC	AbD Serotec	STAR88F	Poliklonalny
Owce przeciwciała anty-ludzkie Vn	AbD Serotec	Zobacz materiał AHP396	Poliklonalny