Ocena wewnątrzkomórkowej fosforylacji białek indukowanej cytokinami zrębowymi za pomocą cytometrii fosfoprzepływowej

Streszczenie

Źródło: Coats, J. S., et al. Ekspresja egzogennej cytokiny w ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów poprzez wstrzyknięcie z linią komórek zrębową transdukowaną cytokinami. J. Vis. Exp. (123) (2017).

Ten film pokazuje ocenę wewnątrzkomórkowej fosforylacji białek w komórkach białaczki wywołanej cytokinami zrębowymi. Te wewnątrzkomórkowe fosforylowane białka są oznaczane ilościowo za pomocą techniki cytometrii fosfoprzepływowej.

Protokół

1. Testy cytometrii fosfoprzepływowej do oceny aktywności cytokin wytwarzanych przez zrąb

UWAGA: Oceń supernatant z zmodyfikowanego zrębu przed pierwszym eksperymentem, aby zweryfikować odpowiednią bioaktywność cytokiny generowanej przez zrąb dla indywidualnego eksperymentu. Po walidacji zmodyfikowanego zrębu dalsze badania nie są konieczne, chyba że zostaną wprowadzone zręby, które zostały wyprodukowane z nowym wektorem.

1. Zakup linii komórkowych białaczki MUTZ5 i/lub MHH-CALL4 (reagujących na TSLP), rekombinowanych cytokin ludzkich i przeciwciał zatwierdzonych do stosowania w testach cytometrii fosfoprzepływowej w celu wykrycia odpowiednich celów fosforylacji.
2. Rozmrozić zebrany supernatant z zrębu kontrolnego i eksprymującego cytokiny.
3. Płytkie linie komórkowe białaczki w pożywce R20 (patrz tabela materiałów) w stężeniu 0,2 x 10⁶ komórek na studzienkę na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Płytka 3 dołki na warunek, aby umożliwić trzykrotne testy. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Czas ten pozwala na utratę fosforylacji, która wystąpiła w poprzednich warunkach hodowli.
   UWAGA: 12 dołków na linię komórkową zapewnia potrójne testy dla każdego warunku eksperymentalnego pokazanego w kroku 1.4.
4. Po 2 godzinach spędzonych w hodowli, przenieść komórki z każdej studzienki do oddzielnych probówek o pojemności 4 ml i odwirować przy 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant.
   1. Zawiesić komórki w 200 μl dla każdego z następujących warunków doświadczalnych (wykonać testy w trzech powtórzeniach): 1) tylko pożywka kontroli ujemnej, 2) pożywka kontroli dodatniej z rekombinowaną cytokiną w stężeniu (stężeniach) nasycenia (TSLP przy 15 ng/ml itd.), 3) supernatant zrębu kontrolnego ze zrębu kontrolnego i 4) supernatant zrębu cytokiny ze zrębu wytwarzającego cytokiny.
5. Inkubować komórki przez czas określony w specyficznym komercyjnym teście fosfologicznym (np. 30 minut dla fosfo-STAT5 w MUTZ5 lub MHH-CALL4 w odpowiedzi na TSLP).
6. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zdekantować supernatant.
7. Wykonaj barwienie metodą cytometrii fosfoprzepływowej zgodnie z protokołem producenta i zbierz dane z cytometrii przepływowej.
8. Analizuj dane cytometrii przepływowej.
   1. Bramka na nienaruszonych komórkach w oparciu o rozproszenie światła do przodu (FSC, wskazuje rozmiar komórki) i z boku (SSC, wskazuje ziarnistość komórki).
   2. Określić medianę intensywności fluorescencji (MFI) nienaruszonych komórek w każdej próbce. Porównaj średnią MFI uzyskaną z potrójnych wartości supernatantu komórek zrębu z wartościami dodatnich i ujemnych pożywek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pipety serologiczne 10 ml	sokół	357551
Probówki stożkowe z polipropylenu o pojemności 15 ml	rybak	05-539-12
Probówki stożkowe z polipropylenu o pojemności 50 ml	sokół	352098
Końcówki do pipet 1 ml	rybak	2707509
Końcówki do pipet 200 μl	Naukowy Denville	Zobacz materiał P3020-CPS
Końcówki do pipet 10 μl	Naukowy Denville	P-1096-CP
Pożywka do hodowli komórkowych "R20", % całkowitej objętości (na 195 ml)			Przepis laboratoryjny
Prędkość obrotowa, 76,84% (150 ml)	Branża medialna	10-040-CV
FBS, 20,49% (40 ml)	Branża medialna	35-011-CV
2 mM L-glutamina, 1,02% (2 ml)	Branża medialna	35-011-CV
1 mM Na pirogronian, 1,02% (2 ml )
Penicylina-streptomycyna, 0,51% (1 ml	Branża medialna	30-002-CL
2-merkaptoetanol, 0,10% (0,1 M), 0,10% (200 μL)	Mp	190242
Biologicznych
Linia komórkowa MHH-CALL-4 "CALL-4", białaczka prekursorowa ludzkich komórek B	Komunikacja DSMZ	Zobacz materiał ACC 337
Linia komórkowa MUTZ-5, białaczka prekursorowa ludzkich komórek B	Komunikacja DSMZ	ACC 490
Rekombinowane ludzkie białko TSLP	Systemy badawczo-rozwojowe	1398-TS-010
Przeciwciała przeciwko cytomerii przepływowej (klon)*
Anty-mysz CD45 FITC (30F11)	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (alternatywna nazwa to IL-7Rα)	Miltenyi Biotec	130-098-094
Transporter opancerzony CD34 (8G12)	BD Nauki biologiczne	340667
CD45 PE-CY7 (HI30)	eBionauka	25-0459
"FVD" Barwnik do utrwalenia żywotności eFluor 780	eBionauka	65-0865
Ig κ lekki łańcuch FITC (G20-193)	BD Pharmingen	555791
Ig λ łańcuch lekki FITC (JDC-12)	BD Pharmingen	561379
IgD PE (IA6-2)	Legenda biologiczna	348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)	BD Nauki biologiczne	551079
pSTAT5 PE, mysz anty-STAT5 (pY694)	BD PhosphoFlow	612567
Inne materiały i wyposażenie
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej FlowJo	FlowJo, Sp. z o.o	Wersja 10
*Wszystkie przeciwciała są przeciwciała przeciwko człowiekowi, chyba że zaznaczono inaczej.

TGL .