$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie tkanek do utrwalania i zatapiania parafiny
UWAGA: Biopsje zostały pobrane od kobiet, które wyraziły na to zgodę, poddanych cystoskopii z elektro-piorunowaniem zapalenia włośnicy w celu zaawansowanego leczenia nawracających infekcji dróg moczowych (rUTI). rUTI definiuje się jako 3 ZUM w ciągu 12 miesięcy. Pobranie biopsji wykonano na sali operacyjnej, gdy pacjent był pod narkozą po uzyskaniu świadomej zgody pacjenta. Wszystkie próbki zostały zakodowane i pozbawione elementów pozwalających na identyfikację przed eksperymentami.
- Pobrać biopsję z zimnego kubka (~1 mm3) z pęcherza moczowego za pomocą kleszczy urologicznych za pomocą elastycznego cystoskopu i natychmiast umieścić w sterylnym kriowiale o pojemności 2 ml zawierającym 1,5 ml paraformaldehydu (PFA) o stężeniu 4% v/v przygotowanym w 1x sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
UWAGA: 4% PFA w 1x PBS można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebne.
- Utrwalić biopsję przez 6 godzin w temperaturze pokojowej lub przez 16-24 godziny w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Czas utrwalenia należy obliczyć na podstawie wielkości próbki tkanki i należy unikać nadmiernego utrwalenia. Nie zaleca się stosowania aldehydu glutarowego jako utrwalacza, ponieważ wprowadza on autofluorescencję.
- W wysterylizowanym kapturze lub komorze bezpieczeństwa biologicznego usuń utrwalacz przez pipetowanie i zastąp go 1,5 ml sterylnego soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1x (PBS). Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C lub natychmiast przeprowadzić obróbkę tkanek i zatapianie parafiny.
- Za pomocą wysterylizowanego mikrotomu należy pokroić bloki tkanek o grubości 5 μm i przykleić skrawki tkanki parafinowej do naładowanych szkiełek mikroskopowych. Wymagane będą co najmniej dwa preparaty na biopsję w przypadku protokołu fluorescencji fluorescencji in situ (FISH) 16S rybosomalnego RNA (16S rRNA).
UWAGA: Tkanka biopsyjna powinna być ułożona w przekroju poprzecznym względem płaszczyzny cięcia, aby zapewnić wizualizację warstw urotelialnych we wszystkich sekcjach. Należy również zauważyć, że grubość przekroju powinna być zoptymalizowana pod kątem wykrywania społeczności bakteryjnych. W przypadku zakażeń, w których bakterie rezydujące w tkankach są bardzo rzadkie (np. <1 bakterii rezydujących w tkance na 1000 komórek ssaków, może być wymagane wykonanie cieńszych skrawków lub pobranie próbek z wielu odcinków seryjnych).
2. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ za pomocą uniwersalnych sond 16S rRNA
UWAGA: Wymagane są dwa preparaty na biopsję. Jedna szkiełko jest potrzebne do uniwersalnej sondy 16S rRNA i jedno szkiełko do sondy kontrolnej z sekwencją zaszyfrowaną. Jest to ważne dla odróżnienia prawdziwego sygnału od sygnału tła podczas mikroskopii, ponieważ nabłonek pęcherza moczowego jest autofluorescencyjny w wielu kanałach. Oprócz sondy mieszającej, zablokowanie 0,1% Sudan Black B przed zamontowaniem może zmniejszyć autofluorescencję tła nieodłącznie związaną z tkanką.
- Przygotowanie odczynników i dygestorium
- Wyczyść pusty wyciąg (lub odpowiednio zamontowaną komorę bezpieczeństwa biologicznego) 70% etanolem.
- Przygotować bufor hybrydyzacyjny składający się z 0,9 M chlorku sodu (NaCl), 20 mM chlorowodorku trisu (hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl, pH 7,2), 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w 10 ml sterylnie przefiltrowanej wody.
UWAGA: Sterylnie przefiltrowaną wodę można przygotować, przepuszczając autoklawowaną wodę destylowaną przez filtr 0,22 μM. Bufor hybrydyzacyjny może być przechowywany w temperaturze pokojowej, ale SDS może wytrącać się z roztworu. Jeśli SDS wytrąci się, przed użyciem podgrzej roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.
- Przygotuj co najmniej 100 ml 95% i 90% etanolu w sterylnie przefiltrowanej wodzie w umytych, autoklawowanych butelkach.
- Rozpuścić znakowane fluorescencyjnie liofilizowane sondy w 10 mM buforze (pH 8,0) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) przygotowanym w sterylizowanej przez filtr wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 100 μM. Przygotować rozcieńczenie 1 μM w buforze TE do użycia w tym protokole. Przechowuj zarówno skoncentrowane sondy o sile 100 μM, jak i odtworzone sondy o pojemności 1 μM w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem.
UWAGA: Nie rozpuszczaj sond znakowanych fluorescencyjnie w wodzie. Buforowanie jest wymagane, aby zapobiec hydrolizie wiązania estrowego N-hydroksysukcynimidu (NHS) sprzężonego z fluoroforem z sondą nukleotydową.
- Umyj pięć słoików Coplin 70% etanolem (EtOH), pozostaw do wyschnięcia, oznacz w następujący sposób: ksyleny I, ksyleny II, 95% EtOH, 90% EtOH, woda podwójnie destylowana (ddH2O) i napełnij 100 ml odpowiedniego roztworu. Pomoże to uniknąć nieporozumień w późniejszych krokach.
- Depatynizacja i rehydratacja tkanek
- W kapturze umieść dwa szkiełka na biopsję w pionowym stojaku na szkiełka.
- Umieść pionowy stojak na suwaki w słoiku z ksylenami I Coplin (zawierającym 100 ml ksylenów) na 10 minut.
- Wyjmij stojak na suwaki z ksylenów I i osusz spód na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar ksylenów. Włożyć do słoika xylenes II Coplin na 10 min.
UWAGA: Nigdy nie pracuj z ksylenami poza certyfikowanym wyciągiem.
- Ponownie uwodnić odparafinowane skrawki tkanek w kolejnych płukaniach etanolem (95% i 90%) przez 10 minut każde w odpowiednio oznaczonych słoikach z kopliny.
UWAGA: Na tym etapie należy ogrzać bufor hybrydyzacyjny do temperatury 50-56 °C w łaźni wodnej.
- Wyjmij ruszt szkiełkowy z mycia 90% etanolem, osusz spód na ręcznikach papierowych, aby usunąć nadmiar etanolu i umieść w słoiku ddH2O Coplin zawierającym 100 ml wysterylizowanego przez filtr ddH2O na 10 minut.
- Czekając na przemycie ddH2O, rozcieńczyć sondy do 10 nM w buforze hybrydyzacyjnym, aby utworzyć roztwór barwiący. Przygotować 150 μl roztworu barwiącego na szkiełko podstawowe
UWAGA: Chroń roztwór barwiący przed światłem, owijając rurki folią aluminiową i przechowując je w szufladzie. Podczas pracy z sondami oznaczonymi fluorescencyjnie na blacie stołu, rozważ wyłączenie świateł górnych, jeśli to możliwe. Sondy rozcieńczone w buforze hybrydyzacyjnym nie powinny być ponownie używane.
- Hybrydyzacja i barwienie przeciwstawne
- Przygotuj komorę nawilżającą dla każdej sondy, umieszczając namoczony, pognieciony Kimwipe i sterylną wodę w zbiorniku pudełka na końcówki P1000. Umieść wkład uchwytu końcówki na górze - w tym miejscu będą znajdować się prowadnice.
UWAGA: Ważne jest, aby używać komory nawilżającej, aby zapobiec wysychaniu skrawków biopsji podczas hybrydyzacji. Należy zauważyć, że dostępne na rynku komory nawilżacza są zaprojektowane tak, aby utrzymywać stabilną, wilgotną atmosferę. Jednak opisana tutaj technika w wystarczającym stopniu kontroluje wilgotność przy znacznie niższych kosztach.
- Wyjmij szkiełka ze stojaka na prowadnice i umieść je na świeżym ręczniku papierowym (chusteczką do góry). Użyj Kimwiste, aby wysuszyć szkiełko. Uważaj, aby delikatnie przetrzeć w pobliżu (nie na) sekcji biopsji, aby odprowadzić wodę. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj obwódkę wokół sekcji biopsji i umieść szkiełko chusteczką do góry w komorze nawilżającej.
UWAGA: Pracuj szybko, aby tkanki nie wyschły przed hybrydyzacją.
- Umieścić komorę nawilżania w inkubatorze ustawionym na 50 °C. Odpipetować 50-150 μl roztworu barwiącego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby prostokąt utworzony przez hydrofobową obwódkę wokół tkanki został wypełniony. Uważaj, aby nie dodać zbyt dużo roztworu, aby przelać hydrofobową granicę. Delikatnie zamknij pudełko.
- Inkubować przez noc (~16 h) w temperaturze 50 °C w ciemności. Jeśli inkubator ma okno, przykryj je folią aluminiową, aby stworzyć ciemne otoczenie.
UWAGA: Temperatura hybrydyzacji poniżej temperatury topnienia sondy FISH jest wymagana do uzyskania wiarygodnego sygnału. 50 °C to optymalna temperatura dla uniwersalnej sondy 16S rRNA, ale może nie być optymalna dla innych sond.
- Następnego ranka przygotuj co najmniej 500 ml buforu do płukania składającego się z 0,9 M chlorku sodu (NaCl) i 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) w ddH2O i przefiltruj do sterylnej butelki z próżniowym filtrem górnym. Podgrzać do 50-56 °C w łaźni wodnej.
- Wyjmij szkiełka z komór nawilżających i ostrożnie usuń pozostały roztwór hybrydyzacyjny za pomocą Kimwipe. Umieść szkiełka w pionowym stojaku do barwienia.
- Umieść ruszt do barwienia w nieprzezroczystym słoiku Coplin zawierającym 100 ml wstępnie podgrzanego buforu do mycia na 10 minut. Jeśli słoiki Coplin nie są nieprzezroczyste (np. szkło), umieść je w ciemności podczas etapów inkubacji - być może pod pudełkiem lub w szufladzie.
- Powtórz krok mycia dwukrotnie ze świeżym buforem do mycia w nowych słoikach Coplin.
- Na etapach płukania należy przygotować barwnik przeciwbarwiący, rozcieńczając roztwór podstawowy Hoechst 33342 1:1 000 w roztworze do płukania. Do tej samej probówki dodaj aglutyninę z kiełków pszenicy Alexa-555 (WGA) do końcowego stężenia 5 μg/ml i Alexa-555 falloidynę do końcowego stężenia 33 nM. Przechowywać w ciemności, aż będzie gotowy do użycia.
UWAGA: Hoechst, Alexa-555 WGA i Alexa-555 Phalloidin oznaczają odpowiednio kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA), mucynę/uroplakiny i aktynę i mogą być przechowywane przez długi czas w ciemności zgodnie z instrukcjami producenta. Etykiety fluorescencyjne stosowane do sond i przeciwbarwień można dostosować do zestawów filtrów dostępnych dla mikroskopu, który ma być używany.
- Wyjmij szkiełka z ostatniego prania i delikatnie odchodź nadmiar bufora do mycia za pomocą Kimwipe. Umieść szkiełka chusteczką do góry na ręczniku papierowym i dodaj 50-150 μl barwnika przeciwdziałającego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby hydrofobowa granica była wypełniona, ale nie przelewała się. Przykryj do czterech szkiełek górną częścią kriopudełka i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Umieść boki z powrotem w stojaku do barwienia i umyj jeszcze dwukrotnie w słoikach Coplin ze świeżym buforem do mycia, przez 10 minut każdy.
- Po ostatnim umyciu dokładnie osusz szkiełka i połóż chusteczkę do góry na ręczniku papierowym pod blatem kriopudełka. Wyciśnij jedną kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na chusteczkę. Delikatnie umieść na wierzchu szkiełko nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze (zależy to od wielkości biopsji). Delikatnie wyciśnij wszelkie pęcherzyki, ponieważ będą one zakłócać obrazowanie, i pozwól szkiełkom z okładką utwardzić się przez noc w ciemności.
- Następnego dnia uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego do szkiełka cienką warstwą bezbarwnego lakieru do paznokci. Pozostawić do wyschnięcia na 10 minut w ciemności, a następnie przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do mikroskopii konfokalnej.
3. Wizualizacja 16S rRNA FISH za pomocą mikroskopii konfokalnej
UWAGA: Dla tego protokołu, najlepsze wyniki osiąga się za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywami 63x i 100x. Wymagane są odpowiednie zestawy filtrów do wizualizacji fluorescencji Hoechst, Alexa-488 i Alexa-555. Jednak standardowa mikroskopia fluorescencyjna może być użyta, jeśli mikroskop konfokalny jest niedostępny. Ten protokół dotyczy laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.
- Włącz mikroskop konfokalny i oprogramowanie komputerowe powiązane z mikroskopem zgodnie z instrukcjami producenta.
- Załaduj szkiełko i wizualizuj za pomocą obiektywu 10x w niebieskim kanale (Hoechst). Ustaw ostrość ostrożnie, aż jądra będą widoczne.
- Po ustawieniu ostrości zmień obiektyw na duże powiększenie (63x lub 100x). Dodaj olej na wierzch szkiełka nakrywkowego. Ponownie ustaw ostrość za pomocą nowego obiektywu, upewniając się, że soczewka obiektywu ma kontakt z olejem podczas ustawiania ostrości.
UWAGA: Używaj precyzyjnego ustawiania ostrości tylko przy dużym powiększeniu (63x lub 100x). Olej powinien być używany tylko do obiektywu olejowego.
- Szybko oceniaj każdy slajd przez okular w kanale zielonym (wzmocnione zielone białko fluorescencyjne, eGFP/Alexa-488), aby określić, które szkiełka są FISH dodatnie, a które FISH ujemne.
UWAGA: Najlepiej jest, jeśli ta wstępna ocena/punktacja jest wykonywana w ciemno przez oddzielną osobę, aby zmniejszyć błąd systematyczny.
- Aby zobrazować barwione biopsje, zacznij od dodatniego slajdu FISH i przejdź do trybu wizualizacji komputerowej. Wybierz kanały 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488) i 555 (Alexa-555). Ustaw otwór otworkowy przy użyciu kanału o najdłuższej długości fali, w tym przypadku 555. Znajdź właściwą płaszczyznę ogniskową do wizualizacji oznakowanych bakterii w kanale 488. Nie zmieniając płaszczyzny ogniskowej, ustaw wzmocnienie, moc lasera i przesunięcie dla każdego kanału tak, aby sygnał nie był nasycony, a tło nie było nadmiernie korygowane. Uzyskaj obraz we wszystkich trzech kanałach.
UWAGA: Użyj tych samych ustawień dla kanału 488, aby wyświetlić obraz każdego slajdu w eksperymencie. Moc lasera może wymagać regulacji w kanałach 405 i 555, jeśli optymalna płaszczyzna ogniskowej do wizualizacji bakterii zmienia się między polami.