Technika in vitro do wytwarzania apoptotycznych limfocytów T za pośrednictwem promieniowania UV

Streszczenie

Źródło: Hodge, M. X., et al. Ocena in vivo efferocytozy makrofagów pęcherzykowych po ekspozycji na ozon. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje metodę wywoływania apoptozy w komórkach Jurkata — linii komórkowej ludzkiej białaczki limfocytów T. Komórki są wystawione na działanie promieniowania ultrafioletowego C (UVC), które powoduje rozległe uszkodzenia DNA i prowadzi do apoptotycznej śmierci komórki.

Protokół

1. Przygotowanie linii komórek T Jurkat (Dzień 2)

UWAGA: Wszystkie procedury powinny być przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.

1. Hodowla limfocytów T Jurkat w 24 ml podłoża do hodowli komórek bazowych + 10% FBS + 5% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C + 5% CO₂ (tabela materiałów). Limfocyty T Jurkat to zawiesinowa linia komórkowa, którą można utrzymywać poprzez pasażowanie 1:6-1:8 do wstępnie ogrzanych pożywek hodowlanych co 3 dni. Nie potrząsać.
2. Aby przygotować komórki apoptotyczne, hoduj je do 90% zbiegu w każdej kolbie (co zajmuje 3-4 dni po pasażowaniu). Do tego badania należy użyć komórek z pięciu kolb T75, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek użytych w tym protokole.
   nuta: Kolba zlewająca się zawiera około 20-24 milionów komórek.
3. Odpipetować komórki (czyli całą kolbę) z każdej kolby (około 24 ml) i przenieść komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej. Użyj wielu stożkowych rurek do wielu kolb.
4. Policz komórki, usuwając 11 μl porcji komórek z probówki stożkowej o pojemności 50 ml i wymieszać z 11 μl barwienia błękitem trypanowym i odpipetować 11 μl na szkiełka hemocytometru.
5. Włożyć szkiełko do automatycznego licznika komórek i zapisać liczbę żywych komórek, aby obliczyć całkowitą liczbę komórek w każdej kolbie, mnożąc liczbę żywych komórek przez 24, ponieważ każda kolba zawiera 24 ml pożywki.
6. Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 271 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu uzyskania granulek.
7. Odrzucić supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce, aby uzyskać 3,0 x 10⁶ komórek na ml.
8. Porcja 5 ml komórek w szalkach do hodowli tkankowych o wymiarach 100 mm x 20 mm (zostanie użytych około dziewięciu szalek; całkowita ilość komórek w każdym szalku powinna wynosić ~15 x 10⁶).
9. Użyj jednego naczynia do kontroli/nienaświetlonej, a pozostałe naczynia będą wystawione na działanie promieniowania UV.
10. Ustaw sieciownik UV na odpowiedni poziom energii, naciśnij przycisk energii i wprowadź "600" za pomocą klawiatury numerycznej, którą urządzenie odczyta jako 600 μJ/cm² x 100,
    nuta: Jednostki energii sieciownika UV są w μJ/cm² x 100; dlatego, aby osiągnąć 60 milidżuli/cm², przelicz jednostki tak, aby pasowały do sieciowania UV.
11. Napromienić wszystkie szalki komórkami, z wyłączeniem kontroli, z prędkością 60 milidżuli (mJ)/^cm2 przy użyciu środka sieciującego UV. Zdejmij górną pokrywę naczyń do hodowli tkankowych podczas ekspozycji na promieniowanie UV, ponieważ światło UV nie przeniknie przez plastikową osłonę.
12. Inkubować wszystkie szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych, w tym kontrolę bez ekspozycji, w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ przez 4 godziny.
13. Potwierdzić apoptozę za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zestawu do wykrywania testu apoptozy zawierającego aneksynę V i jodek propidyny (PI) (markery odpowiednio apoptozy i martwicy) po 4 godzinach inkubacji, zgodnie z instrukcjami producenta.
    nuta: Napromienianie limfocytów T Jurkat w sieciowniku UV na poziomie energii 600 μJ/^cm2, po 4-godzinnej inkubacji doprowadzi do tego, że ≥75% komórek apoptotycznych (zarówno wczesnych, jak i późnych) będzie miało bardziej wczesny fenotyp apoptotyczny niż fenotyp późnej apoptozy. Ułatwia to makrofagom pęcherzykowym ich rozpoznanie i pochłonięcie, ponieważ ich błony są nienaruszone, w przeciwieństwie do późnych komórek apoptozy, co prowadzi do wyższego indeksu efferocytarnego i dokładniejszego obrazowania efferocytozy makrofagów pęcherzykowych w tym badaniu.
    1. Zebrać 333 μl (1 x 10⁶ komórek) limfocytów T Jurkat z kilku szalek (zarówno "bez promieniowania UV", jak i "wystawionych na działanie promieniowania UV") w celu wykorzystania do probówek do analizy kompensacyjnej.
    2. Podwielokrotność 333 μl limfocytów T Jurkat w niebarwionym, pojedynczym barwieniu aneksyny V, pojedynczym barwieniu PI, bez kontroli UV i 600 μJ/^cm2 znakowanych lampami cytometrii przepływowej naświetlanymi promieniami UV.
    3. Odwirować probówki o sile 188 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zdekantować supernatant.
    4. Przemyć komórki przez ponowne zawieszenie w 500 μl zimnej, 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    5. Odwirować i osadzać komórki w stężeniu 188 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.
    6. Przygotuj 400 μl 1x buforu wiążącego na probówkę przepływową, rozcieńczając 10-krotny bufor wiążący wodą destylowaną podczas wirowania komórek.
    7. Przygotować odczynnik do inkubacji aneksyny V i PI (100 μl na próbkę/probówkę) zgodnie z instrukcjami producenta.
    8. Zdekantować supernatant po odwirowaniu i delikatnie zawiesić wszystkie probówki w 400 μl 1x buforu wiążącego, a następnie dodać 100 μl odczynnika do inkubacji aneksyny V do każdej probówki z próbką. Na koniec dodaj 100 μl pojedynczego barwnika aneksyny V i pojedynczego barwnika PI do odpowiednich probówek, ale nie dodawaj niczego poza 1x buforem wiążącym do niebarwionej probówki.
    9. Inkubować probówki w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    10. Odwirować wszystkie komórki przy 188 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zdekantować supernatant.
    11. Ponownie zawiesić komórki w 400 μl 1x buforu wiążącego, a następnie przeanalizować próbki pod kątem apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej. Zbierz co najmniej 10 000 zdarzeń na probówkę, aby umożliwić dokładne odwzorowanie barwienia.
14. Połączyć wszystkie napromieniowane komórki z szalek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i komórek osadkowych przez odwirowanie przy 271 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
15. Odrzucić supernatant z probówki przez aspirację i ponownie zawiesić komórki w 24 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i komórki osadu przez odwirowanie przy 271 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
16. Odrzucić supernatant z probówki przez aspirację i ponownie zawiesić komórki w ilości PBS użytej do dawkowania myszom zatwierdzonej przez IACUC. Stosowana dawka wynosi od 5 do 10 x 10⁶ komórek/50 μl na mysz; dlatego w przypadku 10 myszy należy ponownie zawiesić w 500 μl (liczba komórek w każdej dawce różni się w zależności od liczby komórek hodowanych do napromieniania).
    nuta: Przygotuj co najmniej dwie dodatkowe dawki, aby uwzględnić płyn, który może przywierać do boków końcówki pipety, powodując utratę komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Annexin V-FITC	Trevigen	4830-250-TYS.	Zestaw TACS Annexin V-FITC umożliwia szybką, specyficzną i ilościową identyfikację apoptozy w poszczególnych komórkach przy użyciu cytometrii przepływowej.
Limfocyty T BCL2 Jurkat	Kontroler ATCC (Kontroler T	ATCC CRL-2899 (Kontroler ATCC) CRL-2899	Linia komórkowa BCL2 Jurkat została uzyskana przez transfekcję ludzkich limfocytów T Jurkat z wektorem ekspresyjnym pSFFV-neo ssaków zawierającym ludzką wstawkę BCL-2 ORF i gen oporny na neomycynę. Został przeznaczony do modeli pomiaru efferocytozy.
Hrabina II Automatyczny licznik komórek	Rybak termiczny	AMQAX1000	Jest to laboratoryjna platforma testowa wyposażona w najnowocześniejszą optykę, pełny autofokus i oprogramowanie do analizy obrazu do szybkiej oceny komórek w zawiesinie. Bardzo łatwy w użyciu.
Cytospin 4 Cytowirówka cytocentryczna	Rybak termiczny	A78300003	Zapewnia ekonomiczne cienkowarstwowe preparaty z dowolnej płynnej matrycy, zwłaszcza płynów hipokomórkowych, takich jak płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.
Surowica bydlęca płodowa, kwalifikowana, inaktywowana termicznie	Rybak termiczny	16140071	Dostarcza składniki odżywcze do hodowanych komórek, aby mogły rosnąć. Jest to standard dla hodowli komórkowych.
Penicylina-Streptomycyna	Sigma/Aldrich	P0781-100ML	Penicylina-Streptomycyna jest najczęściej stosowanym roztworem antybiotyku do hodowli komórek ssaków. Dodatkowo służy do utrzymania sterylnych warunków podczas hodowli komórek.
RPMI 1640 Medium, suplement GlutaMAX	Rybak termiczny	61870036	RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) został pierwotnie opracowany do hodowli ludzkich komórek białaczkowych w zawiesinie i jako monowarstwa. Od tego czasu stwierdzono, że pożywka RPMI 1640 jest odpowiednia dla różnych komórek ssaków, w tym HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytów i raków. Pomaga w szybkim i wydajnym wzroście limfocytów T Jurkata.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Środek sieciujący UV	Uniwersytet Naukowy Cambridge	Numer katalogowy: 16659	Środek sieciujący UV Stratalinker jest przeznaczony do indukowania apoptozy, sieciowania DNA lub RNA do nylonu, nitrocelulozy lub membran nitrocelulozowych wzmocnionych nylonem.

powiedział: