$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie próbki
- Zebrać krew obwodową do probówek z heparyną o pojemności 9 ml i utrzymywać próbkę w temperaturze pokojowej (RT) w wirniku do czasu, gdy będzie to wymagane w protokole eksperymentalnym.
- Oznacz probówki cytometryczne o pojemności 5 ml dla kontroli ujemnych (2 probówki), kontroli pozytywnych (2 probówki) i różnych stężeń alergenu/leku (1 probówka na każde badane stężenie alergenu/leku). Umieść rurki w stojaku, w którym rurki idealnie pasują bez poślizgu.
- Przygotować bufor stymulacyjny w wodzie podwójnie destylowanej zawierającej 2% (v/v) HEPES, 78 mg/L NaCl, 3,7 mg/L KCl, 7,8 mg/L CaCl2, 3,3 mg/L MgCl2, 1 g/L HSA. Dostosuj pH do 7,4 i dodaj IL-3 w stężeniu 2 ng/ml. Zazwyczaj przygotowuje się 100 ml i dzieli na 2,5 ml porcji do zamrożenia w temperaturze -20 °C.
- Przygotować kontrole dodatnie w PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): Kontrola pozytywna 1, N-formylometylo-leucylo-fenyloalanina (fMLP) (4 μM), w celu potwierdzenia jakości bazofili; Kontrola pozytywna 2, anty-IgE (0,05 mg / ml) jako kontrola pozytywna za pośrednictwem IgE.
- Przygotować alergen/lek w PBS-T w stężeniu 2x większym niż pożądane stężenie końcowe.
nuta: Optymalne stężenia alergenów/leków, które mają być zastosowane, muszą być wcześniej określone przy użyciu szerokiego zakresu stężeń, za pomocą krzywych dawka-odpowiedź oraz za pomocą badań cytotoksyczności przeprowadzonych zgodnie z tymi samymi etapami protokołu.
2. Przygotowanie mieszanki barwiącej
- Dodać przeciwciała monoklonalne znakowane fluorochromem do buforu stymulacyjnego zgodnie z zalecanym przez producenta stężeniem przeciwciał lub przez wcześniejsze miareczkowanie przeciwciał. W tym protokole dodajemy 1 μl każdego przeciwciała (CCR3-APC i CD203c-PE do identyfikacji bazofili; CD63-FITC do aktywacji bazofilów) na 20 μl buforu stymulacyjnego.
nuta: Preparat do barwienia należy chronić przed światłem.
- Do każdej probówki dodać 23 μl mieszanki barwiącej.
3. Stymulacja krwi
- Dodać 100 μl PBS-T do probówek 1 i 2 (kontrola ujemna), 100 μl fMLP do probówki 3, 100 μl anty-IgE do probówki 4 i 100 μl różnych stężeń alergenu/leku do kolejnych probówek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni termostatycznej ze średnim mieszaniem w celu podgrzania odczynników.
- Delikatnie dodaj 100 μl krwi do każdej probówki, aby uniknąć hemolizy. Delikatnie przetrząsnąć rurki i inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 °C w łaźni termostatycznej ze średnim mieszaniem.
- Zatrzymaj degranulację, utrzymując probówki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 5 minut
nuta: W razie potrzeby protokół można tutaj wstrzymać w temperaturze 4 °C na 30-45 minut.
4. Erytrocyty poddawane lizie
- Dodaj 2 ml 1x buforu lizującego do każdej probówki, aby lizować erytrocyty. Wirować każdą probówkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT.
nuta: Na tym etapie komórki są utrwalane za pomocą środków utrwalających (formaldehydu) zawartych w buforze.
- Odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zdekantować supernatant, przewracając stojak do zlewu. Komórki pozostają na dnie probówek.
- Dodaj 3 ml PBS-T do każdej probówki, aby przepłukać komórki. Wiruj każdą rurkę.
- Wirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Zdekantować supernatant, przewracając stojak do zlewu.
nuta: Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C, chronić je przed światłem do czasu pobrania cytometru przepływowego.
5. Akwizycja cytometrii przepływowej
- Pobieranie próbek za pomocą cytometru przepływowego (np. cytometru przepływowego BD FACSCalibur). Podłącz cytometr przepływowy do oprogramowania komputerowego i poczekaj, aż cytometr będzie gotowy. Załaduj ustawienia szablonu i przyrządu (Tabela 1).
- Rozpocznij pobieranie próbki.
- Użyj następujących strategii cytometru do wyboru aktywowanych bazofili.
- Bramka limfocytów z wykresu Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC).
- Bramka bazofili z populacji limfocytów jako komórki CCR3 + CD203c +. Zdobądź co najmniej 500 bazofili na probówkę.
- Pokaż wykres CCR3 - CD63, aby przeanalizować aktywację przy użyciu CD63 jako znacznika aktywacji. Ustawić ujemny próg CD63 na około 2.5% za pomocą probówek kontroli ujemnej.
- Zbierz wszystkie próbki.
Tabela 1: Wymagania dotyczące cytometru przepływowego
| Źródła światła (lasery) | Laser argonowo-jonowy Coherent SapphireTM chłodzony powietrzem 488 nm; 20 mW; 633 nm Laser chłodzony powietrzem JDS UniphaseTM HeNe; 17 mW |
| Długość fali wzbudzającej światło | Niebieski laser:488 nm; Czerwony laser: 633 nm |
| Moc źródła światła na długości fali wzbudzającej | Niebieski laser: 20 mW; Czerwony laser: 17 mW |
| Filtry optyczne | SSC: 488/10; FITC: 530/30, PE: 585/42, APC: 660/20 |
| Detektory optyczne | FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC |
| Detektory optyczne tye | Laser argonowo-jonowy chłodzony powietrzem |
| Ścieżki optyczne | Ośmiokąt BD (linia laserowa 488 nm); BD Trigons (linia laserowa 633 nm) |