Analiza aktywacji bazofili w obecności testowego alergenu za pomocą cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Doña, I. et al., Test aktywacji bazofili do diagnozy alergii. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie pokazujemy test do oceny aktywacji bazofili w obecności testowego alergenu za pomocą cytometrii przepływowej.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie próbki

1. Zebrać krew obwodową do probówek z heparyną o pojemności 9 ml i utrzymywać próbkę w temperaturze pokojowej (RT) w wirniku do czasu, gdy będzie to wymagane w protokole eksperymentalnym.
2. Oznacz probówki cytometryczne o pojemności 5 ml dla kontroli ujemnych (2 probówki), kontroli pozytywnych (2 probówki) i różnych stężeń alergenu/leku (1 probówka na każde badane stężenie alergenu/leku). Umieść rurki w stojaku, w którym rurki idealnie pasują bez poślizgu.
3. Przygotować bufor stymulacyjny w wodzie podwójnie destylowanej zawierającej 2% (v/v) HEPES, 78 mg/L NaCl, 3,7 mg/L KCl, 7,8 mg/L CaCl₂, 3,3 mg/L MgCl₂, 1 g/L HSA. Dostosuj pH do 7,4 i dodaj IL-3 w stężeniu 2 ng/ml. Zazwyczaj przygotowuje się 100 ml i dzieli na 2,5 ml porcji do zamrożenia w temperaturze -20 °C.
4. Przygotować kontrole dodatnie w PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): Kontrola pozytywna 1, N-formylometylo-leucylo-fenyloalanina (fMLP) (4 μM), w celu potwierdzenia jakości bazofili; Kontrola pozytywna 2, anty-IgE (0,05 mg / ml) jako kontrola pozytywna za pośrednictwem IgE.
5. Przygotować alergen/lek w PBS-T w stężeniu 2x większym niż pożądane stężenie końcowe.
   nuta: Optymalne stężenia alergenów/leków, które mają być zastosowane, muszą być wcześniej określone przy użyciu szerokiego zakresu stężeń, za pomocą krzywych dawka-odpowiedź oraz za pomocą badań cytotoksyczności przeprowadzonych zgodnie z tymi samymi etapami protokołu.

2. Przygotowanie mieszanki barwiącej

1. Dodać przeciwciała monoklonalne znakowane fluorochromem do buforu stymulacyjnego zgodnie z zalecanym przez producenta stężeniem przeciwciał lub przez wcześniejsze miareczkowanie przeciwciał. W tym protokole dodajemy 1 μl każdego przeciwciała (CCR3-APC i CD203c-PE do identyfikacji bazofili; CD63-FITC do aktywacji bazofilów) na 20 μl buforu stymulacyjnego.
   nuta: Preparat do barwienia należy chronić przed światłem.
2. Do każdej probówki dodać 23 μl mieszanki barwiącej.

3. Stymulacja krwi

1. Dodać 100 μl PBS-T do probówek 1 i 2 (kontrola ujemna), 100 μl fMLP do probówki 3, 100 μl anty-IgE do probówki 4 i 100 μl różnych stężeń alergenu/leku do kolejnych probówek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni termostatycznej ze średnim mieszaniem w celu podgrzania odczynników.
2. Delikatnie dodaj 100 μl krwi do każdej probówki, aby uniknąć hemolizy. Delikatnie przetrząsnąć rurki i inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 °C w łaźni termostatycznej ze średnim mieszaniem.
3. Zatrzymaj degranulację, utrzymując probówki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 5 minut
   nuta: W razie potrzeby protokół można tutaj wstrzymać w temperaturze 4 °C na 30-45 minut.

4. Erytrocyty poddawane lizie

1. Dodaj 2 ml 1x buforu lizującego do każdej probówki, aby lizować erytrocyty. Wirować każdą probówkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT.
   nuta: Na tym etapie komórki są utrwalane za pomocą środków utrwalających (formaldehydu) zawartych w buforze.
2. Odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zdekantować supernatant, przewracając stojak do zlewu. Komórki pozostają na dnie probówek.
3. Dodaj 3 ml PBS-T do każdej probówki, aby przepłukać komórki. Wiruj każdą rurkę.
4. Wirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Zdekantować supernatant, przewracając stojak do zlewu.
   nuta: Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C, chronić je przed światłem do czasu pobrania cytometru przepływowego.

5. Akwizycja cytometrii przepływowej

1. Pobieranie próbek za pomocą cytometru przepływowego (np. cytometru przepływowego BD FACSCalibur). Podłącz cytometr przepływowy do oprogramowania komputerowego i poczekaj, aż cytometr będzie gotowy. Załaduj ustawienia szablonu i przyrządu (Tabela 1).
2. Rozpocznij pobieranie próbki.
3. Użyj następujących strategii cytometru do wyboru aktywowanych bazofili.
   1. Bramka limfocytów z wykresu Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC).
   2. Bramka bazofili z populacji limfocytów jako komórki CCR3 ⁺ CD203c ⁺. Zdobądź co najmniej 500 bazofili na probówkę.
   3. Pokaż wykres CCR3 - CD63, aby przeanalizować aktywację przy użyciu CD63 jako znacznika aktywacji. Ustawić ujemny próg CD63 na około 2.5% za pomocą probówek kontroli ujemnej.
   4. Zbierz wszystkie próbki.

Tabela 1: Wymagania dotyczące cytometru przepływowego

Źródła światła (lasery)	Laser argonowo-jonowy Coherent SapphireTM chłodzony powietrzem 488 nm; 20 mW; 633 nm Laser chłodzony powietrzem JDS UniphaseTM HeNe; 17 mW
Długość fali wzbudzającej światło	Niebieski laser:488 nm; Czerwony laser: 633 nm
Moc źródła światła na długości fali wzbudzającej	Niebieski laser: 20 mW; Czerwony laser: 17 mW
Filtry optyczne	SSC: 488/10; FITC: 530/30, PE: 585/42, APC: 660/20
Detektory optyczne	FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC
Detektory optyczne tye	Laser argonowo-jonowy chłodzony powietrzem
Ścieżki optyczne	Ośmiokąt BD (linia laserowa 488 nm); BD Trigons (linia laserowa 633 nm)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, bez nakrętki, niesterylna	Corning	352008
Przeciwciało APC anty-ludzkie CD193 (CCR3)	Legenda biologiczna	310708
BD FACSCalibur Cytometr przepływowy	BD Nauki biologiczne
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C1016
Przeciwciało anty-ludzkie CD63 FITC	Legenda biologiczna	353006
HEPESY (1 m)	Rybak termiczny	15630106
Roztwór lizujący 10x skoncentrowany	BD Nauki biologiczne	349202
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M8266
N-Formyl-Met-Leu-Phe	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F3506
PE przeciwciało anty-ludzkie CD203c (E-NPP3)	Legenda biologiczna	324606
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P9541
Oczyszczone mysie anty-ludzkie IgE	BD Nauki biologiczne	555857
Rekombinowana ludzka IL-3	Systemy badawczo-rozwojowe	203-IL
Płyn do osłonek	BD Nauki biologiczne	342003
chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S3014
PROBÓWKA 9 ml LH Heparyna litowa	Greiner Bio-One	455084
Animacja 20	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P1379

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: