$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie igieł do mikroiniekcji
- Przygotować cienkościenne szklane igły do wstrzykiwań kapilarnych (1,0 OD/0,75 ID) za pomocą ściągacza do mikropipet z następującymi ustawieniami: ciśnienie powietrza 200, ciepło 502, ciągnięcie 90, prędkość 80, czas 70, czas powietrza na początku pociągnięcia 5, czas powietrza na końcu pociągnięcia 5.
- Za pomocą cienkiej pęsety odłamać końcówkę wyciągniętej igły tak, aby otwór końcówki miał średnicę około 10 μm.
2. Przygotowanie potraw do wstrzykiwania larw
- Opłucz grzebień żelowy o szerokości około 4-5 mm w sterylnej wodzie i pozostaw do wyschnięcia.
- Przygotuj 1,5-2% wysokotopliwy roztwór agarozy w podłożu E3 i mikrofalówkę, aż roztwór będzie klarowny. Po ostygnięciu wlej część agarozy na szalkę Petriego (100 x 15 mm) i zamieszaj, dodając tylko tyle agarozy, aby całkowicie pokryła dno naczynia.
- Gdy warstwa agarozy stwardnieje, umieść wypłukany i wysuszony grzebień żelowy na wierzchu tak, aby nieczesany koniec spoczywał tylko na wierzchu szalki Petriego, a czesany koniec dotykał agarozy. Upewnij się, że grzebień jest jak najbardziej poziomy, tworząc kąt 30° w stosunku do dolnej warstwy agarozy.
- Wlej dodatkową niewielką ilość agarozy na styk grzebienia i dolnej warstwy agarozy, tak aby świeża warstwa agarozy pokryła dołki grzebienia. Pozostaw do całkowitego ostygnięcia przed wyjęciem grzebienia. Za pomocą końcówki pipety usuń wszelkie zwisające kawałki agarozy z dołków.
- Wlać pożywkę E3 na wierzch formy wtryskowej i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przed każdym użyciem należy wymienić na świeże podłoże i ciepłe rampy iniekcyjne w temperaturze 28,5 °C na co najmniej godzinę przed wstrzyknięciem.
- Bezpośrednio przed wstrzyknięciem należy zastąpić E3 na rampie iniekcyjnej podłożem E3 zawierającym 200 μg/ml 3-aminobenzoesanu etylu (trikainy).
3. Przygotowanie inokulum Streptococcus iniae (S. iniae)
- Przygotuj i autoklaw pożywki bulionowej Todd Hewitt uzupełnionej 0,2% ekstraktem drożdżowym i 2% peptonem proteozy (THY+P): 30 g/L Todd Hewitt, 2 g/L ekstraktu drożdżowego, 20 g/L peptonu proteozy. W przypadku płytek agarowych dodaj 14 g/l agaru.
- Przygotować kultury bakteryjne na noc przed zakażeniem, pipetując 100 μl podwielokrotności zamrożonego bulionu bakteryjnego do 10 ml bulionu THY+P w szczelnie zamkniętej probówce o pojemności 15 ml. Inkubować przez noc bez mieszania w temperaturze 37 °C. Po 14-16 godzinach wzrostu użyj kultury przez noc, aby przygotować bulion do zamrażania lub przygotować do użycia w zastrzykach.
- Przygotuj wywary do zamrażania, umieszczając 1 ml kultury przez noc w 500 μl 80% glicerolu w probówce wirówkowej o pojemności 1,7 ml. Aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, należy przygotować 100 μl jednorazowych porcji z tej mieszanki i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
- W przypadku S. iniae stosowanych w zakażeniach należy rozcieńczyć posiew na noc w stosunku 1:100 do całkowitej objętości 10 ml kultury, dodając 0,1 ml kultury na noc do 9,9 ml bulionu THY+P. Rosnąć w temperaturze 37 °C bez mieszania przez około 4-5 godzin. Monitoruj gęstość optyczną (OD) przy 600 nm za pomocą spektrofotometru Nanodrop i zbierz bakterie w środkowej fazie logarytmicznej, gdy OD600 nm osiągnie 0,250-0,500. Od600 nm wynoszący 0,250 odpowiada około 108 jednostkom tworzącym kolonie (CFU)/ml.
- Osad 1 ml kultury bakteryjnej w probówce wirówkowej o pojemności 1,7 ml przy 1 500 x g przez 5 minut. Zawiesić w 1 ml świeżej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i powtórzyć. Zmierz OD600 nm bakterii w PBS, osadzie i ponownie zawiesić w PBS, aby osiągnąć pożądane stężenie.
- Aby ułatwić wizualizację mikroiniekcji, dodaj czerwień fenolową do zawiesin bakteryjnych przed wstrzyknięciem, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1%.
- W przypadku eksperymentów polegających na wstrzykiwaniu bakterii zabitych termicznie, należy ogrzewać bakterie w PBS w temperaturze 95 °C przez 30 minut. Potwierdzić, że proces zabijania termicznego zmniejszył liczbę żywych bakterii do niewykrywalnych poziomów, poprzez posiew objętość iniekcji (około 1 nl) na stałych płytkach agarowych THY+P i inkubację przez noc w temperaturze 37 °C.
4. Znakowanie S. iniae za pomocą czerwonego barwnika fluorescencyjnego CellTracker
- Aby oznaczyć żywe komórki bakteryjne, przygotuj roztwór podstawowy barwnika fluorescencyjnego CellTracker lub jego odpowiednika. Ponieważ użyty barwnik występuje w podwielokrotnościach proszku o wymiarach 20 x 50 μg i musi być ponownie zawieszony w dimetylosulfotlenku (DMSO), dodaj 7,3 μl DMSO do probówki, aby uzyskać stężenie podstawowe 10 mM.
- Przetestuj zakres stężeń barwnika (np. 0,5-25 μM) na bakteriach, aby określić najniższe optymalne stężenie, które barwi komórki. Szybko dzielące się komórki i dłuższe eksperymenty mogą wymagać wyższego stężenia barwnika.
- Osad 1,0 ml kultury bakteryjnej w probówce o pojemności 1,7 ml przez odwirowanie, jak opisano powyżej (sekcja 3). Zawiesić osad w 1 ml świeżego PBS i dodać odpowiednią ilość barwnika do kultury bakteryjnej.
- Inkubować bez mieszania w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Odwirować bakterie i ponownie zawiesić w 1 ml wstępnie podgrzanego bulionu THY+P i inkubować bez mieszania przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Odkręć bakterie i umyj je dwa razy w PBS przed pomiarem OD600 nm i rozcieńczeniem bakterii do mikroiniekcji, jak opisano powyżej (sekcja 3). Zazwyczaj wstrzykujemy około 100 CFU w 1 nl objętość iniekcji w naszych badaniach rekrutacji leukocytów i fagocytozy.
5. Przygotowanie larw danio pręgowanego do infekcji
- Ustaw pary lęgowe poprzedniej nocy i zbierz zarodki zgodnie z opisem Rosena i wsp.Inkubować zarodki w pożywce E3 w temperaturze 28,5 °C do momentu, gdy będą gotowe do zakażenia.
- W przypadku danio pręgowanego, który będzie obrazowany, należy zapobiec rozwojowi pigmentu (melanizacji) poprzez dodanie N-fenylotiomocznika (PTU) do pożywki E3 w 24 godziny po zapłodnieniu (hpf) do końcowego stężenia 0,2 nM.
- W przypadku zakażeń obejmujących zarodki w wieku 2 dni po zapłodnieniu (dpf) należy ręcznie usunąć zarodki za pomocą cienkiej pęsety. Alternatywnie, należy dokonać dekorionacji zarodków, usuwając E3 i zastępując je pronazą (2 mg/ml) przez około 5 minut lub do momentu, gdy delikatne pipetowanie odbije zarodki od kosmówki. Większość larw powinna wykluć się naturalnie do 3 dpf.
- Znieczulenie danio pręgowanego należy przeprowadzić na kilka minut przed zakażeniem, umieszczając larwy z odkorzędowaną kosmówką w pożywce E3 zawierającej 200 μg/ml tricainy.
6. Wstrzyknięcie pęcherzyków usznych S. iniae do larw trzydniowych
- Włącz mikrowtryskiwacz i ustaw zakres czasu na "milisekundę". Otwórz zawór na zbiorniku dwutlenku węgla, aby wpuścić gaz do przewodu. Ciśnienie mikrowtryskiwacza powinno wynosić około 20 funtów na cal kwadratowy (PSI). Wyreguluj ciśnienie w zespole mikrowtryskiwaczy, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara czarne radełkowane pokrętło w celu zwiększenia ciśnienia lub obracając w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zmniejszyć ciśnienie.
- Przygotować przygotowaną kulturę S. iniae w czerwieni fenolowej i PBS należy zawirować i za pomocą końcówki mikroładowarki załadować 2-3 μl kultury do ciągniętej igły do wstrzykiwań kapilarnych.
- Zamontuj załadowaną igłę na mikromanipulatorze podłączonym do statywu magnetycznego i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym tak, aby igła znajdowała się pod kątem około 45-65° w stosunku do podstawy mikroskopu.
- Naciśnij pedał nożny mikrowstrzykiwacza, aby dozować kroplę inokulum na końcówkę igły. Zmierz średnicę kropli za pomocą skali w soczewce okularowej mikroskopu.
- Alternatywnie, oszacuj średnicę kropli, wstrzykując objętość do kropli oleju mineralnego na szklanym szkiełku mikroskopowym z paskiem skali. Średnica kropli powinna wynosić około 0,10 mm, co odpowiada objętości około 1 nl.
- Dostosuj wielkość kropli, dostosowując ustawienie czasu trwania na mikrowstrzykiwaczu lub odcinając większą część końcówki igły za pomocą cienkiej pęsety. Należy pamiętać, że czas wstrzyknięcia powinien wynosić od 20 do 35 ms, aby uniknąć spowodowania zbyt dużego uszkodzenia tkanki.
- Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś 12 znieczulonych larw do każdej studzienki formy wtryskowej.
- Użyj szklanego pręta, pętli do włosów lub plastikowej końcówki, aby delikatnie ustawić larwy tak, aby głowy były skierowane w stronę tylnej części mikroskopu, a woreczki żółtkowe znajdowały się po lewej stronie studzienki. Skieruj lewe ucho larwy w stronę sufitu.
- Patrząc przez soczewkę okularową mikroskopu stereoskopowego, użyj pokręteł na mikromanipulatorze, aby wyrównać załadowaną igłę z pęcherzykiem usznym tak, aby obie znajdowały się w tym samym polu widzenia. Przebić zewnętrzną warstwę nabłonka pęcherzyka usznego końcówką igły tak, aby końcówka igły znalazła się tuż wewnątrz pęcherzyka.
- Nacisnąć pedał nożny, aby wstrzyknąć 1 nl żądanej dawki S. iniae. Upewnij się, że używasz wystarczająco niskiego ciśnienia, aby nie pęknąć wnęki. Jeśli wstrzyknięcie się powiedzie, pęcherzyk uszny, ale nie otaczająca go tkanka, powinien wypełnić się inokulum czerwieni fenolowej (ryc. 1 Ai). Natychmiast usunąć wszelkie błędnie wstrzyknięte ryby z płytki iniekcyjnej.
- Ostrożnie wyjąć igłę z larwy i ręcznie przesunąć płytkę iniekcyjną tak, aby następna larwa była widoczna. Zrób to w 5-krotnym powiększeniu.
nuta: Wycofanie igły może spowodować osadzanie się niektórych bakterii poza pęcherzykiem usznym, co może zniekształcić wyniki przeżycia i rekrutacji leukocytów. Aby tego uniknąć, zaleca się wstrzykiwanie bakterii znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym i wizualne skanowanie wstrzykniętych larw pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu usunięcia larw w miejscach, w których to nastąpiło. Prawidłowo wstrzyknięta larwa jest pokazana na (ryc. 1 Bi).
- Aby upewnić się, że objętość wstrzyknięcia/inokulum pozostaje taka sama w trakcie eksperymentu, należy wstrzyknąć kroplę zawiesiny bakteryjnej do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml zawierającej 100 μl sterylnego PBS po każdym 48.zarodku. Umieścić 100 μl na płytkach agarowych THY+P w temperaturze 37 °C przez noc, aby określić jtk w objętości wstrzyknięcia.
- Po wstrzyknięciu całej grupy 12 larw na rampie iniekcyjnej ostrożnie należy użyć plastikowej pipety transferowej, aby usunąć larwy ze studzienek i umieścić je na nowej szalce Petriego (35 x 10 mm2). Usunąć roztwór trykainy i zastąpić go około 2 ml świeżej pożywki E3, aby larwy mogły dojść do siebie.
- Pipetować wstrzyknięte larwy do pojedynczych studzienek na 96-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 28,5 °C. Monitorować larwy w czasie, aby przeżyły na tych płytkach lub usunąć je później w celu obrazowania lub zliczenia CFU.
7. Utrwalanie larw do obrazowania
- Utrwalić larwy w lodowatym 4% roztworze paraformaldehydu w roztworze PBS, jak opisano w sekcji 7.
- W temperaturze pokojowej myć 3 razy po 5 minut w PBS przed obrazowaniem.
8. Przygotowanie larw do obrazowania na żywo
- Przygotuj 1,5% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w E3, podgrzewając go w kuchence mikrofalowej, aż roztwór będzie klarowny.
- Umieścić roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C, aby ostygł, ale nie stwardniał.
- Dodaj trikainę do agarozy do końcowego stężenia 0,016%.
- Za pomocą plastikowej pipety transferowej umieść 4-5 znieczulonych larw w naczyniu ze szklanym dnem na stoliku mikroskopu stereoskopowego.
- Wyjąć roztwór trikainy i agarozy z łaźni wodnej o temperaturze 55 °C i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty. Podczas gdy agaroza stygnie, usuń jak najwięcej płynu ze znieczulonych larw.
- Wlej schłodzoną agarozę do naczynia, aż pokryje się około połowy powierzchni. Zakręć naczyniem, aby rozprowadzić agarozę. Należy pamiętać, że jeśli agaroza jest zbyt gorąca, zabije larwy. Ponadto, jeśli do naczynia zostanie dodana zbyt duża ilość agarozy, soczewka obiektywu mikroskopu może uderzyć w dno naczynia podczas ustawiania ostrości przez agarozę.
- Za pomocą pipety transferowej zbierz larwy, które wypłynęły na boki naczynia i odpipetuj je z powrotem do środka.
- Pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie ustaw larwy zgodnie z potrzebami za pomocą pętli do włosów, długiej końcówki pipety lub szklanego pręta. W celu zobrazowania pęcherzyka usznego należy ustawić larwy tak, aby lewy pęcherzyk uszny przylegał płasko do dna naczynia.
- Pozwól agarozie ostygnąć przez około 10 minut przed przeniesieniem naczynia. Larwy mogą zmieniać pozycje, jeśli agaroza nie jest stała. Delikatnie odpipetuj trochę trykainy i roztworu E3 na wierzch warstwy agarozy, aby była wilgotna.
9. Konfokalne obrazowanie infekcji
- Umieść szklane naczynie z larwami na stoliku mikroskopu odwróconego z laserowym skaningowym systemem konfokalnym FV-1000.
- Ustaw otworek na 200-300 μm i za pomocą soczewki obiektywowej 0,75/20X z aperturą numeryczną ustaw stosy z warstwami 3-6 μm.
- Użyj ciągłego skanowania linii, aby dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora dla każdego kanału.
- Korzystając z sekwencyjnego skanowania liniowego dla każdego kanału fluorescencji (np. 488 i 543 nm) i różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), przeprowadzaj film poklatkowy lewego pęcherzyka usznego co 3 minuty przez 2-6 godzin, aby obserwować wstępną rekrutację i fagocytozę przez neutrofile i makrofagi. W przypadku dłuższych kursów czasu umieść pokrywkę na szalce Petriego, aby zapobiec parowaniu i wysychaniu agarozy.
- Zdobądź nieruchome obrazy stałych (ryc. 1B) lub żywych (ryc. 2) larw w powiększeniu 20x lub 40x.
10. Fotokonwersja leukocytów znakowanych Dendra2 w pęcherzyku usznym
UWAGA: Dendra2 może być fotokonwertowany z zielonej na czerwoną fluorescencję poprzez skupienie lasera 405 nm (50-70% mocy lasera powinno być wystarczające) na obszarze zainteresowania (ROI) przez 1 minutę. Poniżej znajduje się protokół krok po kroku używany dla systemu konfokalnego skanowania laserowego FV-1000:
- Wizualizacja próbki za pomocą skanowania stosu z laserami 488 nm i 543 nm. Użyj ciągłego skanowania linii, aby dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora. Sprawdź, czy nie ma przypadkowo fotokonwertowanej czerwonej fluorescencji.
- W oknie "Kontrola akwizycji obrazu" w sekcji "Ustawienia bodźca" wybierz narzędzie "Użyj skanera" i wybierz "Główny". Wybierz laser 405 nm i ustaw go na 70% mocy. Korzystając z opcji okręgu, zdefiniuj ROI w pęcherzyku usznym.
- W sekcji "Ustawienie startu bodźca" wybierz "Aktywacja szeregowo" z wstępną aktywacją 1 klatki i czasem aktywacji 60 000 ms. W oknie "Ustawienia akwizycji" pod nagłówkiem "Skanowanie czasu" wybierz 2 interwały 00:01:00 (jeden dla pre- i jeden dla post-photokonwersji).
nuta: Po zakończeniu skanowania serii poklatkowej, Dendra2 powinna zostać fotokonwersja do stanu czerwonej fluorescencji.
- Zeskanuj próbkę za pomocą stosu z użyciem laserów 488 nm i 543 nm, aby uwidocznić fotokonwertowaną czerwoną fluorescencję, a także pozostałą zieloną fluorescencję (ryc. 3).
