1. Cytometria przepływowa i sortowanie podtypów limfocytów
UWAGA: Sortowanie limfocytów w zależności od typu komórki jest niezbędne do ustalenia podstawowych (tj. prawidłowych) etykiet typów komórek do trenowania i testowania klasyfikatora typów komórek w nadzorowanym uczeniu. Cytometria przepływowa, złoty standard, służy do identyfikacji i separacji limfocytów.
- Przygotować mieszaninę przeciwciał barwiących markery powierzchniowe w 100 μl świeżej pożywki RPMI-1640 [z 10% FBS, 0,1 μg CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2) i NK1.1 (PK136)] oraz 0,25 μg przeciwciał CD4 (GK1,5) do docelowych limfocytów T, B, CD4+ i CD8+
.
- Dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał do zawiesiny komórek.
- Inkubować przez 25 minut na lodzie.
- Przemyć komórki, dodając 5 ml PBS i dwukrotnie odwirowując przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad komórkowy w 5 ml świeżej pożywki RPMI-1640 z 10% FBS i 2,5 μg DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol).
- Zebrać każdy typ limfocytów oddzielnie za pomocą cytometrii przepływowej, używając poziomów fluorescencji markerów opisanych powyżej. Jednocześnie wykluczaj martwe komórki za pomocą sygnałów DAPI.
2. 3D Ilościowe obrazowanie fazowe
- Trzymaj posortowane limfocyty na lodzie przez cały czas trwania procedur obrazowania, które powinny zostać zakończone w ciągu 5 godzin (od momentu izolacji limfocytów od myszy), aby uniknąć uszkodzenia komórek i zmian biochemicznych.
- Wybierz posortowany typ komórek (spośród limfocytów T B, CD4+ i limfocytów T CD8+) i rozcieńczyć próbkę do 180 komórek/μl pożywką RPMI, aby uzyskać optymalne warunki obrazowania (tj. jedna komórka na pojedyncze pole widzenia).
- Załadować 120 μl rozcieńczonej próbki do komory obrazowania przez powolne wstrzykiwanie. Dokładnie sprawdzić obecność pęcherzyków w komorze obrazowania z próbką. Jeśli są bąbelki, ostrożnie je usuń, ponieważ pogorszą jakość pomiarów.
- Uzyskaj tomogramy 3D RI za pomocą komercyjnego ilościowego mikroskopu fazowego 3D lub holotomografii oraz oprogramowania do obrazowania.
UWAGA: Szczegółowe informacje na temat konfiguracji eksperymentalnej można znaleźć w oryginalnym rękopisie.
- Umieść kroplę wody destylowanej na soczewce obiektywu mikroskopu.
- Umieść komorę obrazowania z próbką na stoliku translacyjnym mikroskopu i dostosuj jej położenie tak, aby próbka zrównała się z soczewką obiektywu.
- Dostosuj pozycje osiowe soczewek obiektywu i kondensora, klikając odpowiednio Ostrość i Powierzchnia na karcie "Kalibracja" perspektywy "Mikroskop" w oprogramowaniu do obrazowania.
- Wyrównaj soczewki obiektywu i kondensatora, klikając przycisk Auto Mode (Tryb automatyczny). Możesz też skorzystać z trybu skanowania i ręcznie wyregulować soczewki tak, aby wzorce oświetlenia były zlokalizowane w centralnym obszarze pola widzenia.
- Wróć do trybu normalnego i dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w polu widzenia.
- Znajdź płaszczyznę ogniskowej, regulując położenie osiowe soczewki obiektywu. Idealne ogniskowanie sprawia, że granica próbki wizualizowana na ekranie jest prawie niewidoczna.
- Dostosuj etap tłumaczenia, aby znaleźć lokalizację bez komórki.
- Kliknij przycisk Kalibruj, aby zmierzyć wiele hologramów 2D o różnych kątach oświetlenia.
- Dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w środku pola widzenia.
- Przejdź do zakładki "Akwizycja" i kliknij Migawka 3D, aby zmierzyć hologramy komórki o identycznych kątach oświetlenia, jak w kroku 2.4.8.
- Po przedstawieniu pozyskanych danych w panelu "Zarządzanie danymi" należy kliknąć prawym przyciskiem myszy na pozyskane dane i kliknąć Procesuj, aby zrekonstruować tomogram 3D RI z hologramów zmierzonych w krokach 2.4.8 i 2.4.10, przy użyciu algorytmu tomografii dyfrakcyjnej zaimplementowanego w oprogramowaniu do obrazowania.
- Powtórz kroki 2.4.5-2.4.11, aby zmierzyć więcej niż 100 komórek, aby zapewnić moc statystyczną dla uczenia maszynowego.
- Wszystkie obrazy, które są przetwarzane w kroku 2.4.11, mogą być wizualizowane. W panelu "Zarządzanie danymi" kliknij dane prawym przyciskiem myszy i kliknij polecenie Otwórz, aby je zwizualizować. Kliknij RI Tomogram w panelu "Menedżer danych". Na karcie "Preset" kliknij Załaduj i kliknij dwukrotnie "lymphocyte.xml", która jest predefiniowaną funkcją transferu dostarczaną przez oprogramowanie do obrazowania w celu wizualizacji tomogramu zgodnie z rozkładami RI 3D.
- Powtórz kroki 2.2-2.4, aby zmierzyć tomogramy 3D RI wszystkich podtypów limfocytów.
