Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB
1. Pobieranie krwi od pacjentów
UWAGA: Podejmij odpowiednie laboratoryjne środki bezpieczeństwa podczas pobierania pełnej krwi od pacjenta. Nosić rękawiczki i okulary. Jeśli pacjent przebywa w izolacji, należy postępować zgodnie z procedurami 4 poziomu bezpieczeństwa biologicznego.
- Aby pobrać dożylnie krew pełną od pacjenta, należy użyć igły motylkowej z rurką przedłużającą o małym otworze i rurki próżniowej do pobierania krwi zawierającej bufor do lizy/wiązania. Oprzyj rękę pacjenta w pozycji skierowanej w dół i umieść rurkę pobierającą niżej niż igła motylkowa. Włóż igłę motylkową do żyły pacjenta i przymocuj rurkę próżniową do pobierania krwi do przedłużki o małym otworze.
nuta: Zapobiegnie to przepływowi zwrotnemu.
- Po pobraniu krwi wymieszaj zawartość probówki, obracając probówkę 5 - 10 razy.
nuta: Ze względu na pozostałą próżnię w probówce do pobierania krwi zawierającej 1,6 ml buforu do lizy/wiązania, objętość pobranej próbki automatycznie wyniesie 1,6 ml.
- Zdezynfekuj zewnętrzną część rurki za pomocą 70% etanolu.
- Inkubować probówki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
nuta: W tym miejscu można wstrzymać protokół, a pełne probówki do pobierania krwi można przechowywać w temperaturze -20 °C, 5 °C, 25 °C lub 37 °C przez co najmniej 1 miesiąc.
- Przejdź bezpośrednio do uproszczonej metody ekstrakcji NA.
2. Uproszczona ekstrakcja NA krwi pełnej
- Aby oczyścić NA z krwi zebranej inaktywowanej buforem do lizy/wiązania, wymieszaj zawartość probówki, obracając rurkę próżniową ręcznie 5 - 10 razy.
- Ostrożnie zdejmij pokrywę rurki i opróżnij pokrywę.
- Wlać przygotowaną porcję MGP (1 ml) bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.
- Umieścić nową pokrywkę z nieużywanej probówki do pobierania krwi na probówce zawierającej próbkę.
- Umieść palec na wieczku, aby upewnić się, że probówka jest szczelnie zamknięta i wymieszaj zawartość probówki, obracając probówkę do pobierania krwi ręcznie 5 - 10 razy.
- Umieść probówkę w uchwycie magnetycznym i przytrzymaj palec na pokrywie, aby upewnić się, że rurka jest szczelnie zamknięta.
- Odwróć kilka razy ręcznie uchwyt magnetyczny z rurką, aby upewnić się, że wszystkie MGP są zebrane z boku rurki z magnesem.
nuta: Uchwyt magnetyczny można zastąpić wydłużonym magnesem i gumową opaską.
- Zdjąć pokrywkę probówki i wyrzucić zawartość probówki za pomocą jednorazowej pipety lub po prostu wsypując zawartość do probówki zbiorczej o pojemności 50 ml.
nuta: Należy unikać wydostawania się aerozoli z probówki o pojemności 50 ml, zamykając probówkę pokrywką.
- Wlać przygotowaną porcję buforu do przemywania -1 (WB-1, 4 ml) bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.
- Umieść pokrywkę na tubie i połóż palec na pokrywce, aby upewnić się, że rurka jest szczelnie zamknięta.
- Wyjmij rurkę z uchwytu magnetycznego, trzymając pokrywę mocno dokręconą palcem.
nuta: Jeśli używasz magnesu i gumowej receptury, po prostu zdejmij gumkę i magnes z tuby.
- Ponownie zawiesić MGP, obracając probówkę do pobierania krwi ręcznie 5 - 10 razy.
- Powtórz kroki 2.6 - 2.8.
- Wlać przygotowaną porcję WB-2 (1,5 ml) bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.
- Umieść pokrywkę na tubie i wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego.
nuta: Jeśli używasz magnesu i gumowej receptury, po prostu zdejmij gumkę i magnes z tuby.
- Umieść palec na pokrywie, aby upewnić się, że rurka jest szczelnie zamknięta.
- Ponownie zawieś MGP, ręcznie obracając probówkę do pobierania krwi na kilka sekund.
- Powtórz kroki 2.6 - 2.8.
- Wlać przygotowaną porcję WB-3 (3 ml) bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.
- Umieść pokrywkę na tubie i wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego.
nuta: Jeśli używasz magnesu i gumowej receptury, po prostu zdejmij gumkę i magnes z tuby.
- Umieść palec na pokrywie, aby upewnić się, że rurka jest szczelnie zamknięta.
- Ponownie zawiesić MGP, obracając probówkę do pobierania krwi ręcznie 5 - 10 razy.
- Powtórz kroki 2.6 - 2.8.
- Wlać przygotowaną porcję buforu elucyjnego (EB, 100 μl) bezpośrednio do probówki do pobierania krwi.
- Umieść pokrywkę na tubie i wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego.
nuta: Jeśli używasz magnesu i gumowej receptury, po prostu zdejmij gumkę i magnes z tuby.
- Zawiesić MGP w EB, stukając palcem w probówkę do pobierania krwi 5 - 10 razy.
nuta: W tym miejscu można wstrzymać protokół, a probówki można przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przenieść jedną kroplę (5 - 8 μl) zawieszonych MGP do dalszej mieszaniny reakcyjnej amplifikacji NA za pomocą jednorazowej pipety o pojemności 1,5 ml (można zastosować dowolny dalszy diagnostyczny test amplifikacji NA, taki jak amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) / lampa z odwrotną transkrypcją (rt-LAMP) lub ilościowe testy łańcuchowej reakcji polimerazy (qPCR)/RT-qPCR).
nuta: Pola na będą trzymać się MGP, więc upewnij się, że używasz MGP w dalszej reakcji amplifikacji NA. Przed użyciem wymieszać zawiesinę MGP. Po wymieszaniu MGP zbiorą się na dnie probówki.
