$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie liposomów
- Obliczyć ilość zawiesinowych roztworów podstawowych 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-kapu biotynylu (Biotyna-PE) zawieszonych w chloroformie, w celu wytworzenia rozcieńczonych roztworów o pożądanym stężeniu końcowym. Aby uzyskać końcowe stężenia 400 μM DOPC i 80 μM fosfolipidów Biotyna-PE po 10 ml każdy, należy rozpocząć od umieszczenia 629 μl 10 mg/ml DOPC i 88 μl 10 mg/ml Biotin-PE w oddzielnych szklanych probówkach chromatograficznych.
UWAGA: ważne jest, aby czyścić szklane strzykawki Hamiltona i szklane probówki chromatograficzne za pomocą roztworu czyszczącego (1 l 95% etanolu do 120 ml wody zawierającej 60 g wodorotlenku potasu, KOH) podczas przenoszenia zawieszonego chloroformem roztworu podstawowego DOPC i Biotyny-PE.
- Wysuszyć chloroform strumieniem argonu w okapie chemicznym. Uszczelnić probówkę chromatograficzną parafilmem.
- Poddaj nowo wysuszone liposomy działaniu wysokiej próżni w liofilizatorze przez noc (O/N), aby usunąć wszelkie pozostałości chloroformu. W celu ukończenia tego samego dnia suszyć przez 60-90 minut.
- Podczas pracy liofilizatora przygotuj trochę buforu do rozcieńczania. Do tego protokołu przygotuj 25 ml składające się z 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; i 2% (wagowo) detergentu n-oktylo-β-D-glukopiranozydu (OG). Najpierw wymieszaj ze sobą pierwsze dwa składniki, a następnie wypiernij tlen argonem przed dodaniem suchego proszku OG. Po przygotowaniu przefiltrować roztwór OG z membraną z octanu celulozy o grubości 0,2 mikrona i przechowywać w temperaturze 4°C.
- Ponadto należy przygotować dwie zakręcane butelki zawierające 1 l buforu tris-soli fizjologicznej o tych samych stężeniach, ale bez OG. Umieść mieszadło magnetyczne oczyszczone wodą destylowaną na dnie każdego z nich. Przygotuj 6 dodatkowych litrów buforu Tris-sola. Usuń tlen ze wszystkich butelek z argonem i umieść je również w temperaturze 4°C.
- Po liofilizacji rozpuść wysuszone lipidy w buforze tris-soli OG, aby uzyskać 4 mM roztwór każdego z nich. Postępując zgodnie z przykładowymi objętościami, dodać 2 ml do probówki DOPC i 0,2 ml do probówki Biotin-PE.
- Wymieszaj ze sobą lipidy biotyny-PE z lipidami DOPC. Poprawia to ruchliwość SLB, ponieważ sprzężona biotyna może osłabiać płynność grup głów fosforanowych. Aby uzyskać końcowe stężenie 80 μM Biotin-PE, należy zmieszać 0,2 ml 4 mM Biotin-PE i 1 ml 4 mM DOPC. Następnie dodać 8,8 ml buforu Tris-soli OG.
- Aby uzyskać końcowe stężenie 400 μM DOPC, wystarczy zmieszać 1 ml 4 mM DOPC z 9 ml Tris-soli OG.
- Napełnij sonikator lodowatą wodą. Umieść szklaną rurkę zawierającą rozcieńczony fosfolipid w środku sonikatora za pomocą zacisku narzędziowego. Sonikować rozcieńczony fosfolipid przez 10 minut, aż roztwór stanie się klarowny.
nuta: Dodaj lód do łaźni wodnej sonikatora, aby utrzymać niską temperaturę, ponieważ sonikacja będzie generować ciepło.
- Napełnij rurki argonem, aby wyprzeć tlen z powietrza i ciecz i uszczelnij je parafilmem.
2. Dializa liposomów
- Wyciąć z rolki dwa odcinki rurki do dializy na sucho (odcięcie masy cząsteczkowej: 12-14 000, średnica: 6,4 mm) o odpowiedniej długości (w tym przykładzie 40 cm), po jednym na każde rozcieńczenie fosfolipidów.
- Ponownie nawodnić odcinki rurek, pozwalając im zanurzyć się w 200 ml wody destylowanej w szklanej zlewce przez 2 minuty.
- Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 5 minut na wysokim poziomie lub przynajmniej do momentu, gdy woda się zagotuje.
- Zawiąż węzeł na jednym końcu każdej rurki i spłucz wnętrze kilkoma mililitrami buforu Tris-saline-OG. Następnie skrupulatnie wyciśnij jak najwięcej tego buforu do mycia, aby zminimalizować ilość buforu pozostającego w środku.
- W okapie z przepływem laminarnym dodaj rozcieńczone fosfolipidy do każdej probówki i zaciśnij otwarte końce małym zamknięciem rurki do dializy, tak aby wykluczyć całe powietrze. Całkowite wykluczenie powietrza będzie wymagało poświęcenia niewielkiej objętości próbki poprzez zaciśnięcie poniżej "linii wodnej".
- Zanurzyć próbki w przygotowanych wcześniej butelkach z buforem tris-soli fizjologicznej bez OG. Wyprzeć tlen z butelki z argonem przed ponownym zamknięciem i umieścić do wymieszania O/N w temperaturze 4°C.
- Przenieść rurkę do nowej butelki buforu Tris-soli fizjologicznej bez OG co 12 godzin przez co najmniej 3 razy.
- Na krótko przed usunięciem dializowanych lipidów należy przygotować kilka małych probówek, do których należy podzielić lipidy, wypełniając każdą z nich argonem w celu wyparcia tlenu.
- Po upływie 36 godzin należy umieścić butelki do dializy w okapie z przepływem laminarnym i wyjąć z nich rurki do dializy. Miej pod ręką pieluchę ławkową lub zlewkę, aby zebrać mokry spływ.
- Przeciąć rurkę do dializy powyżej zacisku, a następnie zdjąć klips i ostrożnie przenieść dializowany roztwór lipidowy za pomocą pipety do podwielokrotności 1 ml we wstępnie przygotowanych probówkach wypełnionych argonem na lodzie.
- Podwielokrotnić wodny roztwór liposomu i użyć strumienia argonu do ponownego wyparcia tlenu w każdej probówce.
- Przechowuj liposomy w temperaturze 4°C. Nie zamrażać.
3. Izolowanie i hodowla ludzkich komórek NK
- Podwielokrotność 15 ml krwi obwodowej lub kożuchy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Rozcieńczyć tę krew solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w stosunku 1:1.
- Delikatnie dodać 13 ml Ficollu na dno probówki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
- Wirować tę probówkę przez 20 minut przy 1 200 x g z akceleratorem i odłamaniem lub przy najniższych ustawieniach.
- Po odwirowaniu należy użyć pipety serologicznej, aby zebrać pływającą, mętną białą warstwę środkową komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), które powinny się usiąść, oraz przecięcie między przezroczystą żółtą górną warstwą a bardziej mętną bladą dolną warstwą, z których obie znajdują się powyżej najniższej warstwy czerwonych krwinek (RBC). UWAGA: Nie zbieraj żadnych RBC podczas zbierania PBMC.
- Umieścić zebrane PBMC w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i rozcieńczyć do pełnej objętości PBS zawierającym 1% FBS. Ponownie odwirować, tym razem z hamulcem i maksymalnie włączonym pedałem przyspieszenia, przez 5 minut przy 300 x g.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml PBS zawierającym 1% FBS.
- Policz komórki, ponownie wirując z tymi samymi ustawieniami, co w kroku 3.6.
- Ponownie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce R10 o gęstości 10 milionów komórek/ml.
- Weź 30 milionów komórek w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml i odizoluj komórki NK za pomocą zestawu do separacji magnetycznej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po wyizolowaniu policz komórki jeszcze raz i ponownie zawieś w gęstości 500 000 komórek/ml w kompletnym pożywce R10 (88% pożywka Roswell Park Memorial Institute, RPMI; 10% FBS; 1% kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy, HEPES; 1% pirogronian sodu) uzupełniony IL-2 (100 U/ml). Hodowla w temperaturze 37° w inkubatorze CO2 i wymiana pożywki 2-3 razy w tygodniu.
4. Montaż dwuwarstwy lipidowej na podłożu płaskim na podłożu
szklanym
- Przygotować 100 ml roztworu piranii, mieszając 30% nadtlenku wodoru z kwasem siarkowym w stosunku 1:3 w zlewce.
nuta: Zawsze wykonuj pracę ze szkodliwymi środkami, takimi jak kwas siarkowy, w odpowiednio przeznaczonym do tego celu okapie chemicznym.
- W tym roztworze zanurz 2 prostokątne szkiełka nakrywkowe #1,5 w roztworze piranii na 20-30 minut.
nuta: Konieczne jest oczyszczenie szkiełek nakrywkowych roztworem piranii.
- Podczas czyszczenia szkiełek nakrywkowych należy pobrać 1 tubkę wcześniej przygotowanych 400 μM lipidów DOPC i 1 tubkę wcześniej przygotowanych 80 μM lipidów Biotyna-PE. Transportuj je na lodzie do zbiornika argonu.
- Wyprzeć tlen w nowej probówce mikrowirówki z argonem, a następnie dodać DOPC i Biotin-PE w stosunku 1:1. Konkretna objętość będzie się różnić w zależności od potrzeb eksperymentalnych, ale powinna wynosić co najmniej 2 μl każda. Ponownie wyprzeć tlen w probówce z mieszaniną za pomocą argonu, a także poszczególnych probówek z odczynnikami, przed powrotem tych ostatnich do lodówki.
- Po zakończeniu czyszczenia dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu na kilka minut.
- Pobrać 1,5 μl mieszaniny liposomów przygotowanej w kroku 5.4 i podać ją w jednej kropli do jednej z komór pasa ruchu na szkiełku komorowym. Użycie 2 kropli na linię jest typowe, ale nie jest konieczne.
- Szybko i sprawnie umieść suche szkiełko nakrywkowe na kropelkach. Upewnij się, że krople są wystarczająco oddalone od siebie, aby nie łączyły się po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego. Ponadto upewnij się, że krople pozostają okrągłe i dobrze zdefiniowane, nie dotykając krawędzi ścianek komory. Mocno dociśnij pomiędzy każdym pasem ruchu i wokół niego, aby zapewnić wodoszczelne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.
- Zaznacz pozycje kropli za pomocą markera.
- Przepuść 100 μl 5% wodnej kazeiny przez komorę, aby zablokować dwuwarstwę. Spróbuj upewnić się, że w komorze przepływowej nie ma pęcherzyków.
- Wstrzyknąć 100 μl streptawidyny w stężeniu 333 ng/ml do każdego toru. Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Następnie przemyć, przepuszczając 3 ml buforowanej soli fizjologicznej HEPES/1% albuminy surowicy ludzkiej (HSA) przez każdy pas w celu usunięcia nadmiaru streptawidyny.
- Dodać 100 μl biotynylowanego, znakowanego fluorescencyjnie anty-CD16, takiego jak Alexa Fluor 568, o stężeniu białka wcześniej uznanym za najbardziej skuteczne. Inkubować w ciemności przez 20-30 minut. Umyć ponownie, przepuszczając 3 ml HBS/1% HSA przez każdą linię.
- Przepuść 100 μl D-biotyny o stężeniu 25 nM przez komorę, aby związać nadmiar streptawidyny, a tym samym wyeliminować ryzyko niespecyficznego wiązania streptawidyny z komórkami.
- Policz komórki NK i ponownie zawiesić w stężeniu 500 000/ml w HBS/1% HSA.
- Podczas wirowania komórek wypłucz D-biotynę z komory za pomocą kolejnych 3 ml HBS/1% HSA na pas
.
- Sprawdź ruchliwość ligandów na SLB poprzez odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (odzysk fluorescencji po fotowybielaniu, FRAP) na całkowitej wewnętrznej fluorescencji odbiciowej (TIRF) lub mikroskopii konfokalnej przed dodaniem komórek NK.
- Gdy komórki zakończą wirowanie i zostaną ponownie zawieszone w pożądanym stężeniu, dodaj 100 μl do każdego pasa.
- Umieść komorę w inkubatorze o temperaturze 37° 5% CO2 na 30-60 minut.
- Po tym okresie inkubacji utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 10-20 minut. Przemyć, przepuszczając 3 ml PBS przez każdą ścieżkę, aby usunąć paraformaldehyd.
- Dodać 400 μl buforu blokującego (5% normalnej surowicy osła i 0,2% Triton X-100 w PBS). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Wybarwić F-aktynę i perforynę, dodając 200 μl rozcieńczonej fluorescencyjnie znakowanej falloidyny (1 jednostka / ml znakowana falloidyna) i znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalnego anty-perforyny (500 ng / ml przeciwciała monoklonalnego anty-perforyny). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
- Zmyć, uruchamiając 3 ml PBS. Komora jest gotowa do obrazowania.
5. Obrazowanie synapsy NK na dwuwarstwie lipidowej za pomocą STED
- Włącz wszystkie niezbędne moduły sprzętowe.
- Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu. Włącz zarówno skanowanie rezonansowe, jak i moduły SED. Po dokonaniu tych wyborów poczekaj około 3-5 minut, aż oprogramowanie się zainicjuje.
- Kliknij zakładkę "Konfiguracja" u góry ekranu.
- Wybierz "Konfiguracja lasera", a następnie włącz białe światło i lasery STED 592 nm.
- Wybierz obiektyw 100x i wyrównaj wiązkę lasera wzbudzenia z laserem zubożającym 592 nm.
- Wybierz moduł "Laser Config", wyłącz laser zubożający 592 i włącz laser zubożający 660 nm.
- Umieść szkiełko na stoliku, nad obiektywem. Ustaw ostrość komórek związanych na wyznaczonym obszarze dwuwarstwowym za pomocą lampy światła białego i okularów.
- Wróć do zakładki "Akwizycja", bezpośrednio po prawej stronie zakładki "Konfiguracja".
- Kliknij zakładkę "Przełącz na światło białe", a następnie włącz ten moduł i przeciągnij linię lasera wzbudzenia na odpowiednią długość fali.
- Wybierz żądany detektor z listy dostępnych, a następnie ustaw zakres wykrywania tak, aby obejmował odpowiedni zakres długości fal.
nuta: NIGDY nie umieszczaj zakresu wykrywania bezpośrednio pod wiązką wzbudzenia.
- Kliknij przycisk "Sekwencjonalny" na pasku narzędzi po lewej stronie, aby wyświetlić okno dialogowe Skanowanie sekwencyjne u dołu lewego paska narzędzi. Dzięki temu użytkownik może dodać wiele sekwencji, z których każda ma inną wiązkę wzbudzenia dla innego koloru. Kliknij "Między ramkami", a następnie ustaw częstotliwość wzbudzenia, detektor i zakres wykrywania dla każdego dodatkowego koloru, jak w krokach 5.9 i 5.10.
- Po zoptymalizowaniu wszystkich ustawień naciśnij "Start", aby rozpocząć proces pozyskiwania.