1. Przygotowanie kontroli
- Przenieść następujące składniki do oddzielnych i odpowiednio oznakowanych probówek o pojemności 1,5 ml:
- Dodaj 500 μl świeżego IMDM zawierającego zawieszone komórki K562 znakowane DiO do probówki o pojemności 1,5 ml z oznaczeniem "podwójnie dodatnim".
- Dodaj 500 μl świeżego IMDM zawierającego ponownie zawieszone komórki K562 znakowane DiO do probówki o pojemności 1,5 ml oznaczonej jako "tylko DiO".
- Dodaj 500 μl świeżego IMDM zawierającego zawieszone nieoznakowane komórki K562 do probówki o pojemności 1,5 ml oznaczonej "tylko jodek propidyny (PI)".
- Umieść probówki podwójnie dodatnie i tylko PI w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C na 5 minut.
- Po upływie 5 minut wyjmij rurki i przetrzyj je 70% etanolem.
- Dodaj 10 l PI do probówek podwójnie dodatnich i PI tylko 1,5 ml.
- Umieścić wszystkie trzy kontrolne komórki docelowe K562 w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut.
- Po upływie 30-minutowej inkubacji odwirować wszystkie trzy kontrolne komórki docelowe K562 przez 2 minuty przy 163 x g.
- Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu komórkowego.
- Zawiesić każdą kontrolę za pomocą 20 μl świeżej pożywki do hodowli komórkowych IMDM i pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na co najmniej 30 minut dla uzyskania optymalnego sygnału DiO.
nuta: Elementy sterujące są teraz gotowe do przeprowadzenia przez obrazowy cytometr przepływowy.
2. Przygotowanie próbki do badania cytotoksyczności
- Przygotuj i oznacz odpowiednio probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki/uczestnika.
- Pipeta wymagała proporcji komórek NK i komórek K562 znakowanych DiO w każdej probówce.
UWAGA: Na przykład pożądany stosunek komórek docelowych K562 i komórek efektorowych NK wynosi 1:5.
- Wirować przez 5 minut przy 135 x g.
- Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu komórkowego.
- Zawiesić mieszaninę komórek K562 znakowaną NK-DiO w 500 μl pożywki komórkowej NK bez interleukiny-2 (IL-2) i 2-merkaptoetanolu (2-ME) (niekompletna pożywka do hodowli komórek NK).
UWAGA: Niekompletną pożywką do hodowli komórek NK jest Minimum Essential Medium Eagle z wodorowęglanem sodu, bez L-glutaminy, rybonukleozydów i dezoksyrybonukleozydów.
- Dodaj 5 μl PI do każdej probówki.
- Wirować przez 2 minuty przy 163 x g.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
- Po 2 godzinach inkubacji odwirowywać przez 2 minuty przy 163 x g.
- Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu komórkowego.
- Zawiesić komórki w 25 μl niekompletnej pożywki do hodowli komórek NK.
3. Przygotowanie próbki spontanicznej ("S")
- Odpipetować 500 μl komórek K562 znakowanych DiO (stężenie 1 x 106 komórek/ml) do probówki o pojemności 1,5 ml.
- Dodaj 10 μl PI do każdej probówki.
- Probówka wirówkowa przez 2 minuty przy 163 x g.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
- Po 2 godzinach inkubacji odwirowywać przez 2 minuty przy 163 x g.
- Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu komórkowego.
- Ponownie zawiesić komórki w 25 μl niekompletnej pożywki niezbędnej pożywki o minimalnym alfa (α-MEM).
4. Akwizycja danych za pomocą obrazującego cytometru przepływowego
- Naciśnij zielony przycisk wewnątrz przednich drzwiczek obrazowego cytometru przepływowego, aby włączyć instrument.
- Włącz wszystkie komputery skojarzone z obrazowym cytometrem przepływowym.
- Uruchom oprogramowanie cytometru przepływowego do obrazowania.
- Kliknij przycisk "Uruchamianie", aby przepłukać system i przygotować linię próbkowania.
- Po zakończeniu "Uruchamiania" zamknij okno "Kalibracje".
- Przypisz kanały: w lewym górnym rogu kliknij każdy kanał, aby je przypisać.
- Po prawej stronie kliknij przycisk wykresu punktowego, aby utworzyć 4 wykresy rozrzutu: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 i FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
- Rozpocznij analizę próbek, najpierw używając kontroli "Podwójnie dodatniej".
- Kliknij "Załaduj".
- Umieścić probówkę o pojemności 1,5 ml z próbką "podwójnie dodatnią" z kroków od 1.4 do 1.8 w ładowarce próbek.
- Wybierz obiektyw 40X w zakładce "Powiększenie".
- Włącz lasery o mocy 405 mW i 642 mW.
- Włącz kanał "Brightfield".
- Kliknij "Wybierz intensywność".
- Na podstawie próbki kontrolnej "Double Positive" określ żądaną intensywność lasera o mocy 405 mW, aby detektor nie był przeciążony.
nuta: Na przykład optymalne natężenie dla tego eksperymentu ustalono na 11 mW.
- Po osiągnięciu żądanej konfiguracji uzyskaj dane.
- Na karcie "Pobieranie plików" wprowadź niestandardowy tekst nazwy pliku. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki danych.
- Wprowadź liczbę komórek do pobrania obok opcji "Zbierz". Zazwyczaj liczba ta waha się od 1 000 do 10 000.
- Kliknij "Pobierz."
UWAGA: Po uzyskaniu żądanej liczby komórek plik danych jest automatycznie zapisywany w poprzednio wybranym folderze.
- Po zakończeniu akwizycji załaduj następną próbkę kontrolną – tylko kontrolę DiO.
- Kliknij "Załaduj".
- Umieść probówkę o pojemności 1.5 ml z próbką "Tylko DiO" w ładowarce próbek.
- Pozostaw wybrany obiektyw 40X w zakładce "Powiększenie".
- Pozostaw włączony laser o mocy 405 mW.
- Wyłącz laser o mocy 642 mW i kanał "Brightfield".
UWAGA: Teraz, gdy żądana konfiguracja została osiągnięta, można uzyskać dane.
- Na karcie "Pobieranie plików" wprowadź niestandardowy tekst nazwy pliku i wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki danych. Wprowadź liczbę komórek do pobrania obok opcji "Zbierz". Zazwyczaj liczba ta wynosi 1,000.
- Kliknij "Pobierz."
nuta: Po uzyskaniu żądanej liczby komórek plik danych jest automatycznie zapisywany w poprzednio wybranym folderze.
- Powtórzyć krok 4.10 dla próbki kontrolnej "tylko PI". Próbki eksperymentalne są teraz gotowe do pobrania.
- Z pozostałymi próbkami eksperymentalnymi, w tym z "próbkami spontanicznymi »S«" należy postępować w następujący sposób:
- Pozostaw wybrany obiektyw 40X w zakładce "Powiększenie".
- Włącz lasery o mocy 405 mW i 642 mW.
- Włącz kanał "Brightfield".
- Kliknij "Ustaw intensywność".
- Na karcie "Pobieranie plików" wprowadź niestandardowy tekst nazwy pliku i wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki danych. Wprowadź niestandardowy tekst nazwy pliku.
- Wprowadź liczbę komórek do pobrania obok opcji "Zbierz".
- Kliknij przycisk "Pobierz".
nuta: Po uzyskaniu żądanej liczby komórek plik danych jest automatycznie zapisywany w poprzednio wybranym folderze.
- Powtórzyć krok 4.12 dla wszystkich próbek doświadczalnych.
- Po zebraniu wszystkich danych i plików eksperymentalnych kliknij przycisk "Zamknij", aby wysterylizować system.
5. Analiza próbki za pomocą cytometru przepływowego do obrazowania
- Otwórz aplikację do obrazowania cytometru przepływowego.
- W sekcji "Plik" otwórz eksperymentalny. Plik RIF.
- Zbuduj nową matrycę przy użyciu jednego koloru. RIF files (kontrola tylko DiO i kontrola tylko PI, utworzone w krokach 4.10 i 4.11), wybierając opcję "Utwórz nową matrycę" w zakładce Kompensacja w oprogramowaniu cytometru przepływowego do obrazowania.
UWAGA: Oprogramowanie poprosi o wybór plików jednokolorowych i połączy je w celu utworzenia pliku macierzy (rozszerzenie pliku .ctm), który ma zostać wybrany w celu zastosowania kompensacji kanałów.
- Twórz wykresy punktowe za pomocą funkcji "bloków konstrukcyjnych" oprogramowania.
- Utwórz wykres kropkowy (BrightFieldGradient_RMS a częstotliwość), aby zabramować skoncentrowane komórki. Wywołaj bramkę "Focus" (Rysunek 1A).
- Korzystając z bramki "Focus", utwórz wykres punktowy obszaru jasnego pola w stosunku do proporcji jasnego pola, aby zabramować komórki singletowe. Nazwij bramkę "Pojedyncza" (Rysunek 1B).
- Korzystając z bramki "pojedynczej", utwórz wykres punktowy Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Użyj tego wykresu, aby zidentyfikować i bramkować tylko komórki DiO-dodatnie (cele, żywe) i komórki podwójnie dodatnie PI-DiO (cele, martwe) (rysunek 1C).
nuta: Wszystkie wykresy opisane w krokach 5.4.1, 5.4.2 i 5.4.3 można utworzyć za pomocą funkcji "bloków konstrukcyjnych" oprogramowania.
- Kliknij funkcję statystyczną wykresu kropkowego, aby uzyskać dostęp do numerów komórek każdej bramy.
- Obliczyć odsetek martwych celów w próbce spontanicznej i próbkach doświadczalnych, stosując następujący wzór:
% martwych celów w próbie = (#dead celów x 100)/(#live celów + #dead celów)
- Obliczyć cytotoksyczność, korzystając z następującego wzoru:
% cytotoksyczności = [(Eksperymentalny martwy-Spontanicznie martwy)/(100-Spontanicznie martwy)]x100
