Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Ogólne przygotowanie ludzkich PCLS i późniejsza ekspozycja na chemikalia
UWAGA: Do napełnienia płuca potrzebne są dwie osoby. Zalecana jest aktualna książeczka szczepień przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu A i B. Pacjenci są rutynowo poddawani badaniom przesiewowym w kierunku HCV i HIV przed przeszczepieniem płuc. W przypadku zdiagnozowania lub podejrzenia czynnego zakażenia Mycobacterium tuberculosis należy odrzucić płuco. Niemniej jednak cała świeża ludzka tkanka płucna i pobrane z niej próbki muszą być traktowane jako potencjalnie zakaźne i muszą zostać podjęte odpowiednie środki ochronne (maski z filtrem cząstek stałych (FFP2), okulary ochronne, rękawice) w celu zapewnienia bezpieczeństwa pracy personelu. Zabieg trwa 60 - 90 min.
- Potwierdź nienaruszony ludzki płat płuca.
nuta: Pęknięcie opłucnej uniemożliwia jednorodne wypełnienie tkanki. Materiał z płuc ludzkich musi pochodzić z dnia resekcji. Tolerowane są okresy przechowywania około 2 godzin w temperaturze pokojowej (RT) przed napełnieniem go agarozą na lodzie. Tkanka, którą wykorzystujemy w tym protokole, pozyskiwana jest od pacjentów poddawanych resekcji. Nie pochodzi od zmarłych pacjentów. Jeśli tkanka była przechowywana na lodzie, przed napełnieniem należy ją wstępnie ogrzać do temperatury pokojowej, w przeciwnym razie agaroza natychmiast ulegnie polimeryzacji i nie będzie możliwe jednorodne wypełnienie.
ostrożność: Upewnij się, że wszystkie osoby mające kontakt z rodzimym materiałem ludzkim zakładają odzież ochronną składającą się z fartucha laboratoryjnego, dwóch par rękawiczek, czapki, maski na twarz i pary okularów ochronnych. Materiał ludzki jest potencjalnie zakaźny.
- Odważyć 7,5 g agarozy o niskiej żelytacji i dodać ją do 250 ml wody destylowanej dwudestylowanej. Gotuj agarozę w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Schłodzić do około 40 °C, w zależności od temperatury topnienia i żelowania agarozy.
nuta: Wymaganych jest kilka kolb, w zależności od wielkości płata.
- Wstępnie ogrzać i utrzymać pożywkę hodowlaną (tabela materiałów) w temperaturze 37 °C.
nuta: Jeśli agaroza jest zbyt gorąca, witaminy w pożywce hodowlanej stracą skuteczność, a komórki zostaną uszkodzone. Jeśli temperatura roztworu pożywki/agarozy jest niższa niż 37 °C, rozpoczyna się proces żelowania, który pogarsza jednorodne wypełnienie płuc. Zalecany jest tylko zakres temperatur od 37 °C do 39 °C.
- Przed rozpoczęciem umieść wszystkie wymagane materiały w zasięgu ręki: 5 - 10 zacisków, elastyczny cewnik o długości około 1 m, odpowiednią strzykawkę (np. 50 ml) pasującą do połączenia z cewnikiem oraz pojemnik na lód wypełniony lodem.
- Kankaniutować tchawicę/oskrzela główne, wkładając rurkę silikonową i mocując ją za pomocą zacisku zorientowanego równolegle do rurki, tak aby zacisk ściskał tkankę razem wzdłuż rurki silikonowej bez jej ściskania. Sprawdź, czy rurka silikonowa jest zamocowana w środku i nie może wysunąć się podczas procedury napełniania. Zamknij wszystkie inne oskrzela, naczynia krwionośne i urazy zaciskami, aby agaroza nie mogła wyciekać podczas procedury napełniania.
- Zmieszać równoważną objętość 3% agarozy o niskiej żelowości z pożywką hodowlaną w zlewce. Wkraplanie mieszaniny do płuc za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml. Przed ponownym napełnieniem strzykawki pożywką należy zacisnąć cewnik palcami lub zaciskiem, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i refluksu agarozowego. Wypełnij płat płuca, aż zostanie całkowicie napompowany. Ostrożnie dotknij opłucnej płucnej z boku; Opłucna powinna być równa i twarda.
nuta: W zależności od wielkości płata płuc może być wymagane do 2 lub 3 l roztworu agarozy/podłoża .
- Powtórz kroki 1,5 - 1,6 dla każdego oskrzela w przypadku kilku oskrzeli w jednej próbce.
- Płuco należy umieścić na lodzie w celu polimeryzacji agarozy do żelu na 20 - 40 minut, w zależności od ilości wkroplonej agarozy. Ostrożnie dotknij opłucnej z kilku stron, aby sprawdzić, czy jest twarda i chłodna, wskazując, że polimeryzacja została zakończona, w przeciwnym razie kontynuuj czekanie. Niech patolodzy pokroją płuco na plasterki, pobiorą próbki i przechowają materiał płucny na lodzie do transportu.
- Ludzką tkankę płucną pociąć ostrym nożem na 3 - 5 cm kawałki.
nuta: Użyj nowego ostrza do każdego płuca, aby zapewnić ostrość.
- Napełnij krajalnicę do chusteczek 400 ml lodowatego roztworu soli Earle's Balanced Salt (EBSS). Natychmiast wyciąć cylindryczne rdzenie tkankowe z płyt płuc za pomocą półautomatycznego śrubokręta z narzędziem do wiercenia o preferowanej średnicy (np. 8 mm; 10 mm).
nuta: Średnica ta musi być równa średnicy uchwytu na chusteczki wewnątrz maszyny.
- Dostosuj grubość plastrów płuc do żądanej wartości grubości.
nuta: Grubość około 250 μm jest powszechnie stosowana w eksperymentach PCLS. Producent krajalnicy do tkanek zaleca miernik grubości plastra tkanki w celu weryfikacji grubości plasterka. Alternatywnie, barwienie całością w połączeniu z mikroskopią konfokalną może być użyte do określenia grubości plastra.
- Przenieś rdzenie tkanek do uchwytu na tkanki krajalnicy do tkanek. Umieść ciężarek (część uchwytu na chusteczkę) na wierzchu rdzenia tkanki. Ustaw prędkość ramienia i prędkość ostrza na 6 na slicerze do tkanek. Rozpocznij krojenie rdzenia tkanki na PCLS.
- Uzupełnij 500 ml dostępnego w handlu zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM): Mieszanka składników odżywczych F-12 DMEM/F12 (1:1) z 5 ml penicyliny (10 000 jednostek/ml) i streptomycyny (10 000 μg/ml). Przechowuj pożywkę hodowlaną przez kilka dni w sterylnych warunkach w lodówce. Podgrzej tylko wymaganą objętość podłoża.
nuta: Penicylina zostanie dezaktywowana, jeśli będzie przechowywana w temperaturze 37 °C przez dłuższy czas. Używaj pożywki hodowlanej bez surowicy i bez barwników, ponieważ skład surowicy różni się w zależności od partii, a barwniki, takie jak czerwień fenolowa, mogą zakłócać testy.
- Napełnij szalkę Petriego (100 x 15 mm) 25 ml lodowatej pożywki hodowlanej. Pożywkę należy odsączyć z krajalnicy do tkanek do zlewki, otwierając zacisk szklanego cylindra. Przenieść plastry ze zlewki na szalkę Petriego z pożywką hodowlaną za pomocą aplikatora (np. pętli inokulacyjnej). Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności). Poczekaj, aż podłoże się rozgrzeje przed etapami prania.
nuta: Wszystkie dalsze etapy wykonywane są w sterylnych warunkach.
- Umieścić sitko do komórek na szalce Petriego w celu umycia PCLS. Całkowicie usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml przez sitko do komórek i dodać 25 ml wstępnie podgrzanej świeżej pożywki o temperaturze 37 °C. Powtarzaj ten krok 3 - 4 razy co 30 minut.
nuta: Sitko do komórek zapobiega zasysaniu plastrów do pipety, aby uniknąć ich uszkodzenia.
- Ostrożnie przenieść wycinki płuc na 24-dołkową płytkę hodowlaną z co najmniej 500 μl pożywki hodowlanej na dwa plastry na dołek.
nuta: Do transferu najlepiej użyć pętli do zaszczepiania i pozwolić plasterkom unosić się na pętli, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek. Nie jest konieczne dalsze oddzielanie plastrów, ponieważ tylko niedobór wystarczającej ilości świeżej pożywki spowoduje śmierć komórek w wycinkach tkanki. Plastry mogą nachodzić na siebie lub stykać się ze sobą w studzience: nie ma to wpływu na żywotność tkanek.
