Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Ogólne przygotowanie precyzyjnie wyciętych ludzkich plastrów płuc (PCLS) i późniejsza ekspozycja na chemikalia
UWAGA: Do napełnienia płuca potrzebne są dwie osoby. Zalecana jest aktualna książeczka szczepień przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu A i B. Przed przeszczepieniem płuc pacjenci są rutynowo poddawani badaniom przesiewowym na obecność wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) i ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). W przypadku zdiagnozowania lub podejrzenia czynnego zakażenia Mycobacterium tuberculosis należy odrzucić płuco. Niemniej jednak cała świeża ludzka tkanka płucna i pobrane z niej próbki muszą być traktowane jako potencjalnie zakaźne i muszą zostać podjęte odpowiednie środki ochronne (maski z filtrem cząstek stałych (FFP2), okulary ochronne, rękawice) w celu zapewnienia bezpieczeństwa pracy personelu. Zabieg trwa 60 - 90 min.
- Potwierdź nienaruszony ludzki płat płuca.
nuta: Pęknięcie opłucnej uniemożliwia jednorodne wypełnienie tkanki. Materiał z płuc ludzkich musi pochodzić z dnia resekcji. Tolerowane są okresy przechowywania około 2 godzin w temperaturze pokojowej (RT) przed napełnieniem go agarozą na lodzie. Tkanka, którą wykorzystujemy w tym protokole, pozyskiwana jest od pacjentów poddawanych resekcji. Nie pochodzi od zmarłych pacjentów. Jeśli tkanka była przechowywana na lodzie, przed napełnieniem należy ją wstępnie ogrzać do temperatury rzeczywistej, w przeciwnym razie agaroza natychmiast ulegnie polimeryzacji i nie będzie możliwe jednorodne wypełnienie.
ostrożność: Upewnij się, że wszystkie osoby mające kontakt z rodzimym materiałem ludzkim zakładają odzież ochronną składającą się z fartucha laboratoryjnego, dwóch par rękawiczek, czapki, maski na twarz i pary okularów ochronnych. Materiał ludzki jest potencjalnie zakaźny.
- Odważyć 7,5 g agarozy o niskiej żelytacji i dodać ją do 250 ml wody destylowanej dwudestylowanej. Gotuj agarozę w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Schłodzić do około 40 °C, w zależności od temperatury topnienia i żelowania agarozy.
nuta: Wymaganych jest kilka kolb, w zależności od wielkości płata.
- Wstępnie ogrzać i utrzymać pożywkę hodowlaną (tabela materiałów) w temperaturze 37 °C.
nuta: Jeśli agaroza jest zbyt gorąca, witaminy w pożywce hodowlanej stracą skuteczność, a komórki zostaną uszkodzone. Jeśli temperatura roztworu pożywki/agarozy jest niższa niż 37 °C, rozpoczyna się proces żelowania, który pogarsza jednorodne wypełnienie płuc. Zalecany jest tylko zakres temperatur od 37 °C do 39 °C.
- Przed rozpoczęciem umieść wszystkie wymagane materiały w zasięgu ręki: 5 - 10 zacisków, elastyczny cewnik o długości około 1 m, odpowiednią strzykawkę (np. 50 ml) pasującą do połączenia z cewnikiem oraz pojemnik na lód wypełniony lodem.
- Kankaniutować tchawicę/oskrzela główne, wkładając rurkę silikonową i mocując ją za pomocą zacisku zorientowanego równolegle do rurki, tak aby zacisk ściskał tkankę razem wzdłuż rurki silikonowej bez jej ściskania. Sprawdź, czy rurka silikonowa jest zamocowana w środku i nie może wysunąć się podczas procedury napełniania. Zamknij wszystkie inne oskrzela, naczynia krwionośne i urazy zaciskami, aby agaroza nie mogła wyciekać podczas procedury napełniania.
- Zmieszać równoważną objętość 3% agarozy o niskiej żelowości z pożywką hodowlaną w zlewce. Wkraplanie mieszaniny do płuc za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml. Przed ponownym napełnieniem strzykawki pożywką należy zacisnąć cewnik palcami lub zaciskiem, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i refluksu agarozowego. Wypełnij płat płuca, aż zostanie całkowicie napompowany. Ostrożnie dotknij opłucnej płucnej z boku; Opłucna powinna być równa i twarda.
nuta: W zależności od wielkości płata płuc może być wymagane do 2 lub 3 l roztworu agarozy/podłoża .
- Powtórz kroki 1,5 - 1,6 dla każdego oskrzela w przypadku kilku oskrzeli w jednej próbce.
- Płuco należy umieścić na lodzie w celu polimeryzacji agarozy do żelu na 20 - 40 minut, w zależności od ilości wkroplonej agarozy. Ostrożnie dotknij opłucnej z kilku stron, aby sprawdzić, czy jest twarda i chłodna, wskazując, że polimeryzacja została zakończona, w przeciwnym razie kontynuuj czekanie. Patolodzy pokroją płuco na plasterki, pobiorą próbki i przechowają materiał płucny na lodzie do transportu.
- Ostrym nożem pokrój ludzką tkankę płucną na 3-5 cm kawałki.
nuta: Użyj nowego ostrza do każdego płuca, aby zapewnić ostrość.
- Napełnij krajalnicę do chusteczek 400 ml lodowatego roztworu soli Earle's Balanced Salt (EBSS). Natychmiast wyciąć cylindryczne rdzenie tkankowe z płyt płuc za pomocą półautomatycznego śrubokręta z narzędziem do wiercenia o preferowanej średnicy (np. 8 mm; 10 mm).
nuta: Średnica ta musi być równa średnicy uchwytu na chusteczki wewnątrz maszyny.
- Dostosuj grubość plastrów płuc do żądanej wartości grubości.
nuta: Grubość około 250 μm jest powszechnie stosowana w eksperymentach PCLS. Producent krajalnicy do tkanek zaleca miernik grubości plastra tkanki w celu weryfikacji grubości plasterka. Alternatywnie, barwienie całościowe w połączeniu z mikroskopią konfokalną może być użyte do określenia grubości warstwy, jak opisano przez Brismara i wsp.
- Przenieś rdzenie tkanek do uchwytu na tkanki krajalnicy do tkanek. Umieść ciężarek (część uchwytu na chusteczkę) na wierzchu rdzenia tkanki. Ustaw prędkość ramienia i prędkość ostrza na 6 na slicerze do tkanek. Rozpocznij krojenie rdzenia tkanki na PCLS.
- Uzupełnij 500 ml dostępnego w handlu zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM): Mieszanka składników odżywczych F-12 DMEM/F12 (1:1) z 5 ml penicyliny (10 000 jednostek/ml) i streptomycyny (10 000 μg/ml). Przechowuj pożywkę hodowlaną przez kilka dni w sterylnych warunkach w lodówce. Podgrzej tylko wymaganą objętość podłoża.
nuta: Penicylina zostanie dezaktywowana, jeśli będzie przechowywana w temperaturze 37 °C przez dłuższy czas. Używaj pożywki hodowlanej bez surowicy i bez barwników, ponieważ skład surowicy różni się w zależności od partii, a barwniki, takie jak czerwień fenolowa, mogą zakłócać testy.
- Napełnij szalkę Petriego (100 x 15 mm) 25 ml lodowatej pożywki hodowlanej. Pożywkę należy odsączyć z krajalnicy do tkanek do zlewki, otwierając zacisk szklanego cylindra. Przenieść plastry ze zlewki na szalkę Petriego z pożywką hodowlaną za pomocą aplikatora (np. pętli inokulacyjnej). Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności). Poczekaj, aż podłoże się rozgrzeje przed etapami prania.
nuta: Wszystkie dalsze etapy wykonywane są w sterylnych warunkach.
- Umieścić sitko do komórek na szalce Petriego w celu umycia PCLS. Całkowicie usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml przez sitko do komórek i dodać 25 ml wstępnie podgrzanej świeżej pożywki o temperaturze 37 °C. Powtórz ten krok 3 - 4 razy co 30 minut.
nuta: Sitko do komórek zapobiega zasysaniu plastrów do pipety, aby uniknąć ich uszkodzenia.
- Ostrożnie przenieść wycinki płuc na 24-dołkową płytkę hodowlaną z co najmniej 500 μl pożywki hodowlanej na dwie próbki na dołek. Wystawić tkankę płucną na działanie substancji (patrz kroki 3.1 - 3.4), np. przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
nuta: Do transferu najlepiej użyć pętli do zaszczepiania i pozwolić plasterkom unosić się na pętli, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek. Nie jest konieczne dalsze oddzielanie plastrów, ponieważ tylko niedobór wystarczającej ilości świeżej pożywki spowoduje śmierć komórek w wycinkach tkanki. Plastry mogą nachodzić na siebie lub stykać się ze sobą w studzience: nie ma to wpływu na żywotność tkanek.
- Umieścić cały pozostały materiał ludzki w plastikowej kolbie z utrwalaczem (np. 10% buforowanym formaldehydem) na co najmniej 24 godziny i spalić go w procesie utylizacji.
ostrożność: Formaldehyd jest toksyczny, wykonaj ten krok pod maską.
2. Przygotowanie roztworów dla substancji
UWAGA: Przygotuj działające roztwory i kontrole bezpośrednio przed użyciem.
UWAGA: Z substancjami należy obchodzić się zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa lub, jeśli nie są znane, jako potencjalnie szkodliwe i przestrzegać rutynowych środków ostrożności.
- Substancje rozpuszczalne w wodzie rozpuścić bezpośrednio w pożywce hodowlanej. W przypadku nierozpuszczalnych lub słabo rozpuszczalnych substancji chemicznych należy najpierw rozpuścić substancję w odpowiednich rozpuszczalnikach w zależności od rozpuszczalności substancji. Substancje o ograniczonej rozpuszczalności w wodzie (<0,1 mg/ml) można rozpuścić, na przykład w dimetylosulfotlenku (DMSO) lub etanolu. Stężenia nietoksycznych rozpuszczalników należy wcześniej oznaczyć przez miareczkowanie. Upewnij się, że substancje nie wytrącają się z roztworu po rozcieńczeniu do podłoża.
UWAGA: przygotowuje się roztwory heksachloroplatynianu amonu (HClPt) i laurylosiarczanu sodu (SLS).
- Przygotować roztwory podstawowe substancji o stężeniu 100-krotnym od pożądanego najwyższego stężenia w pożywce hodowlanej lub rozpuszczalniku. Odważyć 12,5 mg HClPt i 34,4 mg SLS i przygotować roztwory podstawowe, rozpuszczając substancje chemiczne w 1 ml pożywki hodowlanej.
nuta: Do tych chemikaliów nie jest wymagany rozpuszczalnik .
- Przygotować końcowe rozcieńczenie w stosunku 1:100 we wstępnie podgrzanym podłożu. W przypadku wcześniejszego użycia rozpuszczalnika, podejście to prowadzi do uzyskania takiego samego końcowego stężenia rozpuszczalnika dla wszystkich stężeń substancji.
- Końcowe stężenie rozpuszczalnika (np. 1%, jak opisano w kroku 3.3) należy zastosować do referencyjnego traktowania PCLS. Nie była wymagana kontrola rozpuszczalnika w przypadku substancji chemicznych wymienionych w sekcji dotyczącej wyników.
3. Pozytywne i negatywne referencje dla testów cytotoksyczności
- Dla wszystkich testów żywotności należy przygotować następujące kontrole dodatnie i ujemne:
- Kontrola tkankowa: inkubować PCLS w pożywce hodowlanej wyłącznie jako odniesienie dla PCLS niepoddanych działaniu substancji przez 24 godziny w warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 5% CO2, wilgotność 100 %).
- Kontrola nośnika (w razie potrzeby): inkubować PCLS z końcowym stężeniem rozpuszczalnika jako odniesieniem dla PCLS poddanych działaniu samego nośnika (patrz etap 3.4) przez 24 godziny w warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 5 % CO2, 100 % wilgotności).
- Kontrola pozytywna: inkubować PCLS z 1% detergentem w roztworze buforowym przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
nuta: Jeśli PCLS stanie się bezbarwny, tkanka jest martwa. Całkowita dehydrogenaza L-mleczanowa (LDH) jest oznaczana w supernatancie, przy absorpcji około 1,9 - 2,3. Tkanka jest używana do testu WST-1, z absorpcją około 0.
4. Pomiar chemicznie indukowanej cytotoksyczności u ludzkich PCLS za pomocą rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolowej (WST-1)
Test
UWAGA: Test WST-1 jest wykonywany na 24-dołkowej płytce z dwoma PCLS na dołek. Najlepiej użyć duplikatów dla każdego parametru i zebrać wyniki tych duplikatów po pomiarze.
- Przygotować roztwór roboczy, rozcieńczając odczynnik WST-1 w pożywce bezpośrednio przed rozpoczęciem. Wymagana ilość roztworu roboczego to 250 μl/dołek z płytki 24-dołkowej. Dlatego należy zmieszać 25 μl odczynnika z 225 μl pożywki dla jednego dołka.
- Po inkubacji PCLS z kroku 1.16 należy odrzucić lub użyć supernatantu do pomiarów cytokin lub innych testów, takich jak test LDH. Pozostała tkanka jest używana do następnego kroku.
- Odmierzyć pipetą 250 μl stężenia roboczego odczynnika WST-1 do dołka i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę. Upewnij się, że PCLS są całkowicie pokryte odczynnikiem WST-1 podczas inkubacji.
- Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej (200 obr./min) i ostrożnie wstrząsać przez 30 s, aby zapewnić dokładne wymieszanie odczynnika WST-1. Pobrać nową płaskodenną 96-dołkową płytkę i odpipetować 100 μl w dwóch egzemplarzach z supernatantu z każdego dołka 24-dołkowej.
- Zmierzyć absorpcję każdej studzienki przy 450 nm (odniesienie: 630 nm) za pomocą czytnika mikropłytek. Odjąć absorpcję przy 630 nm od 450 nm. nuta: Wiarygodne dane do oceny cytotoksyczności można uzyskać tylko z żywotnej tkanki. Dlatego te opublikowane kryteria akceptacji powinny być spełnione w każdym eksperymencie. Jeśli te kryteria nie są spełnione, eksperyment należy powtórzyć.
- Wchłanianie kontrolnej pożywki niepoddanej działaniu substancji powinno wynosić powyżej 0,6, w przeciwnym razie eksperyment należy powtórzyć. Jeśli dane spełniają ten wymóg, należy ustawić wartość absorpcji kontroli tkankowej na 100% i obliczyć redukcję WST-1 próbek poddanych działaniu substancji w stosunku do kontroli tkankowej.
