1. Przygotowanie pożywki splenocytowej i buforu cytometrii przepływowej
- Wykonaj wszystkie czynności pod okapem biologicznym oczyszczonym w 70% etanolem.
- Wyjmij 70 ml wstępnie podgrzanego podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (dostępnego w handlu i dostarczanego w przefiltrowanych sterylnych butelkach o objętości 500 ml) i umieść w sterylnej probówce. Usunięte medium zostanie użyte w dalszej części protokołu.
- Uzupełnij pozostałe 430 ml RPMI 1640 1x 50 ml inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowego (HEPES), 5 ml aminokwasów endogennych, 5 ml pirogronianu sodu i 0,05 ml przefiltrowanego (1M) 2-merkaptoetanolu.
nuta: Wstępnie podgrzej pożywkę splenocytową za pomocą łaźni wodnej ustawionej na 37 ºC, aby uniknąć szoku cieplnego komórek. Jest to ważne, aby uniknąć indukcji apoptozy komórkowej.
- Aby przygotować bufor do cytometrii przepływowej, dodać 2 ml FBS do 98 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przechowywać w lodówce do czasu użycia (najlepiej w ciągu trzech dni).
2. Wytwarzanie zawiesiny komórek splenocytów z śledziony myszy Nur77GFP
- W asepcie odizoluj śledzionę od 6-8 tygodniowej samicy myszy Nur77GFP.
- Aby to osiągnąć, pracuj pod sterylnym kapturem. Namocz ofiarowane futro myszy, nożyczki i kleszcze w 70% etanolu.
- Połóż mysz na prawym boku i przetnij skórę i mięśnie w lewym górnym kwadrancie brzucha. Sprawdź obszar nacięcia, aby widocznie zlokalizować śledzionę, a następnie ją wytnij. Trzymaj śledzionę w podłożu splenocytowym na lodzie, aż będzie gotowa do wykonania następnego kroku.
- Umieścić śledzionę (śledziony) na 10-centymetrowej szalce Petriego z2 kulturami komórkowymi zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki ze splenocytów.
- Rozgnieść śledzionę za pomocą sterylnego tłoka strzykawki, aż roztwór stanie się mętny. Macierz kolagenowa śledziony powinna pozostać do końca zabiegu.
- Po intensywnym zacieraniu w pożywce splenocytowej zebrać zawiesinę komórek i przepuścić ją przez sitko o wielkości 70 μm umieszczone na probówce o pojemności 50 ml w celu odfiltrowania wszelkich zanieczyszczeń lub skrzepów.
- Wirować przy 500 x g przez 5 min. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 2-3 ml wyprodukowanego we własnym lub komercyjnym buforze do lizy krwinek czerwonych. Po pipetowaniu (2-3 razy) odstawić zawiesinę na 20-30 sekund.
- Dodać 5 ml PBS lub odpowiedniego wybranego buforu, a następnie odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 500 x g.
- Usunąć supernatant (powinien być koloru czerwonego, ponieważ zawiera lizowane krwinki czerwone) i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki splenocytowej.
- Za pomocą hemocytometru policz liczbę komórek wybarwionych błękitem trypanowym, aby odróżnić komórki żywe od martwych (martwiczych).
3. Izolacja limfocytów T z zawiesiny komórek splenocytów
- Odwirowywać zawiesinę komórek przez 5 minut przy 500 x g. Ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI bez surowicy (50 ml od kroku 1.3), aby uzyskać stężenie komórkowe 10 x 106 komórek/ml.
- Przenieść komórki do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml i odłożyć na bok 100 μl podwielokrotności splenocytów w celu oceny/porównania czystości na końcu etapu oczyszczania.
- Dodać normalną surowicę szczura do zawiesiny komórkowej w stężeniu 50 μl / ml, a następnie koktajl przeciwciał izolujących limfocyty T (50 μl / ml).
- Wymieszaj zawiesinę komórkową i odstaw na 10 minut. Ten krok pozwala koktajlowi przeciwciał związać wszystkie niechciane komórki.
- Dodaj szybkie kulki streptawidyny (kulki magnetyczne) na 2,5 minuty, a następnie doprowadź objętość do 2,5 ml za pomocą pożywki bez surowicy.
- Umieść rurkę w magnesie izolującym komórki na 3 minuty.
- Przenieś zawiesinę limfocytów T do nowej rurki polistyrenowej, przytrzymując magnes i wylewając roztwór jednym ruchem.
nuta: Wyizolowana zawiesina zawiera oczyszczone limfocyty T. Wszystkie niechciane komórki są trzymane z boku rurki związane z magnetycznymi kulkami streptawidyny.
- Policz wyizolowane limfocyty T za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
nuta: Na tym etapie czystość wyizolowanych limfocytów T można zweryfikować (opcjonalnie), analizując procent zdarzeń CD3 + przed i po izolacji limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej.
- Krótko odwirować 1 ml zawiesiny komórek splenocytu o stężeniu 500 x g. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w buforze cytometrii przepływowej o stężeniu 1 x 10,6 komórek/ml.
- Dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-mysie CD3 w stężeniu 1:100. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przemyć raz, odwirować i ponownie zawiesić w buforze cytometrii przepływowej (400 μl) w celu analizy metodą cytometrii przepływowej.
4. Aktywacja limfocytów T i indukcja ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP)
- Zasiać limfocyty T w zawiesinie na okrągłodennej 96-dołkowej płytce o stężeniu 2,5 x 105 komórek/dołek.
- Dodaj rekombinowaną interleukinę (IL)-7 w stężeniu 2 ng/ml i kulki magnetyczne CD3/CD28 (25 μl/106 komórek). Utrzymuj część limfocytów T niepotraktowaną kulkami, aby służyła jako kontrola negatywna dla późniejszych pomiarów, które reprezentują nieaktywowane limfocyty T.
- Dwanaście godzin później zbierz limfocyty T z 96-dołkowej płytki, delikatnie pipetując zawiesinę komórek w każdym dołku w górę iw dół, aby rozbić wszelkie kompleksy/agregaty komórek koralikowych. Zebrać zawiesinę ze wszystkich studzienek do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml.
- Umieść probówkę zawierającą zawiesinę w tym samym magnesie izolacyjnym komórek, który był wcześniej używany do oczyszczania limfocytów T i pozwól jej odpocząć przez 5 minut.
- Przenieś zawiesinę limfocytów T do nowej rurki polistyrenowej, przytrzymując magnes i wylewając roztwór jednym ruchem.
- Odwirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w świeżym pożywce splenocytowej, aby uzyskać stężenie 2 x 106 komórek/ml.
- Oceń intensywność ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej (opcjonalnie do kontroli jakości) po 12 do 24 godzinach od stymulacji w porównaniu z nieaktywowanymi limfocytami T. 12
nuta: Fluorescencja GFP jest nieodłączna od limfocytów TNur77 GFP i objawia się po pomyślnej aktywacji receptora komórek T, TCR.
- W celu oceny żywotności i aktywacji (opcjonalnie) za pomocą mikroskopii, wybarwić aktywowane komórki preparatem Hoechst 30 minut przed analizą w stężeniu 0,2 μg/ml. Dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórek do szkiełka nakrywkowego lub studzienki płaskodennej czarnej płytki 384-dołkowej i zbadać pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu oceny żywych komórek. Martwe komórki nie zachowają barwienia jądrowego.
5. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) małych cząsteczek
- Przygotować zawiesinę komórek w ilości 2 x 106 komórek/ml aktywowanych limfocytów T (kulki magnetyczne lub przeciwciała/CD40L) lub grup nieaktywowanych.
- Umieść 75 000 komórek/basenik na płytce 384-dołkowej (objętość 40 μl). Użyj płaskodennej, czarno-ściennej płytki 384-dołkowej lub szkiełka podstawowego mikroskopu do oceny żywotności i aktywacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (opcjonalny etap kontroli jakości przed HTS) przy użyciu barwienia Hoechst (szczegółowe informacje znajdują się w krokach 4.8).
- Ręcznie lub za pomocą automatycznego systemu dodać wybrane leki (rozpuszczone w 0,5% sultlenku dimetylu, DMSO) do każdej studzienki.
- Dodać nośnik (DMSO) do dodatnich (aktywowanych) i ujemnych (nieaktywowanych) studzienek kontrolnych. Dostosuj stężenie DMSO do maksimum 0,5%.
- Inkubować płytki przez 24 godziny (lub czas inkubacji do wyboru) w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla, CO2 .
- W dniu badania przesiewowego rozcieńczyć roztwór barwienia Hoechst 33342 (1:3,333; np. dodać 10 μl do komórek w płytkach 384-dołkowych, aby uzyskać całkowitą objętość 50 μl). Barwienie 30 minut przed analizą GFP poprzez dodanie roztworu Hoechsta do uzyskania stężenia 0,2 μg/ml.
- Delikatnie pipetować komórki w górę i w dół, aby uzyskać jednorodny rozkład w każdym dołku.
nuta: Ten etap jest ważny w przypadku dozowania leków (krok 5.3) przy użyciu zautomatyzowanego systemu, ponieważ komórki mają tendencję do gromadzenia się po jednej stronie studzienki, przeciwnej do kierunku przepływu.
- Wirować płytki w temperaturze 45 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
- Pozostaw talerze na 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Wykonaj odczyt płytek, korzystając z automatycznego systemu konfokalnego przesiewania o wysokiej zawartości (HCS). Załaduj płytkę do maszyny. Ustaw obiektyw na powiększenie 40x lub większe. Użyj kamery #4 dla Hoechst (lampa UV) i kamery #1 dla GFP (laser 488). Ustaw maszynę tak, aby odczytywała 6-10 pól na dołek. Wyreguluj maszynę tak, aby wykonywała dwa sekwencyjne odczyty na pole przy 488 nm (do odczytu GFP) i świetle UV (do odczytu Hoechst). Ustaw obiektyw na powiększenie 40x lub większe.
nuta: System jest mikroskopem komputerowym, który nie wymaga żadnych regulacji. Odległość ogniskowa, intensywność padającego światła i czas ekspozycji są ustawiane automatycznie przez maszynę.
