Test oparty na fluorescencji z wykorzystaniem zmodyfikowanych limfocytów do badań przesiewowych związków immunomodulujących

Abstract

Źródło: Fouda, A., et al., A Test limfocytów oparty na fluorescencji odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek. J. Vis. Exp., (2017).

Ten film pokazuje badanie przesiewowe związków immunomodulujących za pomocą testu fluorescencyjnego. Transgeniczne limfocyty T pochodzące od myszy z kasetami ekspresji białek zielonej fluorescencji są traktowane tymi związkami. Wzmocnione i zredukowane sygnały GFP umożliwiają identyfikację odpowiednio stymulującego i hamującego działania związków.

Protocol

1. Przygotowanie pożywki splenocytowej i buforu cytometrii przepływowej

1. Wykonaj wszystkie czynności pod okapem biologicznym oczyszczonym w 70% etanolem.
2. Wyjmij 70 ml wstępnie podgrzanego podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (dostępnego w handlu i dostarczanego w przefiltrowanych sterylnych butelkach o objętości 500 ml) i umieść w sterylnej probówce. Usunięte medium zostanie użyte w dalszej części protokołu.
3. Uzupełnij pozostałe 430 ml RPMI 1640 1x 50 ml inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowego (HEPES), 5 ml....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myszy Nur77GFP	Laboratorium Jacksona	Szczep myszy nr 016617	W naszym zakładzie dla zwierząt powstała kolonia
96 płytek hodowlanych Wells-U, sterylnych	VWR Polska	Numer katalogowy 10062-902	Aktywacja limfocytów T za pomocą kulek magnetycznych
Sitko do komórek 70 μm, sterylne	Corning Inc.	Numer katalogowy: 352350	Wytwarzanie zawiesiny komórkowej splenocytów
5 ml probówki z okrągłym dnem z polistyrenu, sterylne	Corning Inc.	352058	Wytwarzanie zawiesiny komórkowej splenocytów
50 ml polipropylenowe stożkowe probówki denne, sterylne	VWR Polska	Numer katalogowy: 89039-656	Wytwarzanie zawiesiny komórkowej splenocytów
Strzykawka 10 ml bez igły, sterylna	Becton, Dickinson i spółka	305482	Aby zmiażdżyć śledzionę
5 ml naczynie do hodowli komórkowych, sterylne	Greiner Bio-One	627 160	Aby zmiażdżyć śledzionę
Penicylina- Streptomycyna (10 000 U/ml)	WISENT Inc.	450-200-EL	Składnik pożywki splenocytów
RPMI 1600 z wodorowęglanem sodu i L-glutaminą	WISENT Inc.	350-002-CL	Składnik pożywki splenocytów
Aminokwasy endogenne MEM	WISENT Inc.	321-010-EL	Składnik pożywki splenocytów
Kwas wolny od HEPES 1 M	WISENT Inc.	330-050-EL	Składnik pożywki splenocytów
Roztwór pirogronianu sodu (100mM)	WISENT Inc.	600-110-EL	Składnik pożywki splenocytów
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	WISENT Inc.	Numer katalogowy: 080-910	Składnik pożywki splenocytowej i buforu cytometrii przepływowej
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	WISENT Inc.	311-010-CL	Składnik bufora cytometrii przepływowej
2-merkaptoetanol (55mM)	Thermo Fisher Naukowy	21985-023	Składnik pożywki splenocytów
Zestaw do izolacji limfocytów T	Technologie komórek macierzystych	Rok 19851	Aby wyizolować limfocyty T
Koraliki superparamagnetyczne Mysz T-Activator CD3/CD28	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy 11452D	Aby aktywować limfocyty T
Magnes izolacyjny komórki	Technologie komórek macierzystych	18000	Aby wyizolować limfocyty T i usunąć kulki magnetyczne
Rekombinowana mysia IL-7	Peprotech	217-17	Aby wspomóc przeżycie limfocytów T podczas aktywacji
Przeciwciało anty-mysie CD3	BD Pharmingen	561799	Do barwienia limfocytów T w cytometrii przepływowej
Biomed FXp	PerkinElmer Sp. z o.o.	Nr kat. A31842	Aby ponownie zawiesić komórki po 24 godzinach inkubacji
System badań przesiewowych o wysokiej zawartości Opera Phenix	PerkinElmer Sp. z o.o.	HH14000000	Do analizy sygnału GFP/Hoechst