$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Konfiguracja instrumentu
UWAGA: Obrazowanie lewitujących komórek wymaga umieszczenia dwóch magnesów neodymowych ziem rzadkich namagnesowanych na osi z tym samym biegunem skierowanym do siebie w celu wytworzenia pola magnetycznego. Odległość między magnesami można dostosować w zależności od intensywności pola magnetycznego i gęstości celów. W tym przypadku magnesy są oddzielone przestrzenią o szerokości 1 mm, wystarczającą do włożenia kwadratowej szklanej rurki kapilarnej o długości 50 mm 1x1 mm. Urządzenie zostało wydrukowane w 3D przy użyciu projektu AutoCAD, który jest dostępny na życzenie.
- Połóż mikroskop na boku, idealnie poziomo.
nuta: Mikroskop umieszczony w standardowej pozycji pionowej nie nadaje się bezpośrednio do obrazowania lewitujących obiektów ze względu na położenie magnesów względem kondensatora i obiektywu. Ograniczenie to można obejść, umieszczając mikroskop na boku, idealnie poziomo, co pozwala kondensatorowi skupić światło w kapilarze, a soczewce obiektywu obrazować ogniwo lewitujące między magnesami, przy zachowaniu wymagań dotyczących oświetlenia Köhlera.
- Podeprzyj i wypoziomuj stojak na stole do krojenia chleba za pomocą 2 lub 3 podnośników laboratoryjnych.
- Aby ograniczyć wibracje, podeprzyj stół do krojenia chleba gumowymi nóżkami tłumiącymi.
- Usuń stolik i zastąp go kompaktowym podnośnikiem laboratoryjnym do regulacji wysokości urządzenia lewitującego (oś y) oraz dwoma jednoosiowymi stopniami translacyjnymi; jeden do regulacji ostrości (oś z), a drugi do skanowania rurki kapilarnej.
- Przymocuj urządzenie lewitacji magnetycznej do gniazda laboratoryjnego za pomocą dwóch słupków optycznych z serii mini.
2. Wiązanie przeciwciała z mikrocząstkami/kulkami karboksylowymi (zmodyfikowane na podstawie protokołu przez PolyAn)
UWAGA: Tylko koraliki o niskiej gęstości (1,05 g/ml) muszą być powlekane do wykrywania Rh, Rh(+), ale zarówno koraliki o wysokiej, jak i niskiej gęstości są powlekane do wykrywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
- Wyjąć 1 mg ekwiwalentu zawiesiny kulek i dodać do 0,5 ml buforu aktywacyjnego (50 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego, MES (MW195.2, 9,72 mg w 1 ml)) pH 5,0 i 0,001% polisorbatu-20).
- Dodać 12 μl świeżo przygotowanego 1,5 M chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) (MW 191,7, 0,28755 g w 1 ml) i 12 μl 0,3 M sulfo-N-hydroksysukcynimidu (NHS) (MW 217.14, 0,0651 g w 1 ml) w lodowatej wodzie.
- Umieść probówki na wytrząsarce orbitalnej i energicznie potrząsaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby aktywować grupy karboksylowe na kulkach.
- Zatrzymaj aktywację po 1 godzinie, dodając 0,5 ml buforu sprzęgającego (10x sól fizjologiczna buforowana fosforanem, PBS lub 0,1 M fosforan o pH 7-9).
Granulki należy granulować- , odwirowując przy 20 000 x g przez 10 minut lub, jeśli kulki nie mogą być granulowane, użyć filtra probówkowego o średnicy 0,45 μm. Zassać supernatant lub przepływ.
- Umyj koraliki 1 ml 10x PBS 3 razy, jak w kroku 2.5.
- Obliczyć 25 μg przeciwciała na kulki mg i wymieszać pożądane przeciwciało z aktywowanymi kulkami do końcowego stężenia przeciwciał 0,7-1,0 mg / ml w 10X PBS.
- Umieść rurki na wahaczu rurowym ustawionym na niską prędkość. Delikatnie zwiń rurki w temperaturze pokojowej przez noc w celu połączenia.
- Powtórz krok 2.5 i umyj koraliki dwukrotnie 1 ml 10x PBS.
- Przemyć 0,5 ml 1 M etanoloaminy (98% bulionu = 16,2 M) w buforze o pH 8,0 z 0,02% polisorbatem-20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
- Powtórz krok 2.5 i umyj kulki raz w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Kulki można przechowywać w 200 μl DPBS w temperaturze 4 °C do momentu ich potrzebowania.
nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
3. Pobieranie i przygotowanie krwi do wykrywania Rh(+)
- Za pomocą nakłuwacza jednym kliknięciem nakłuj palec dawcy Rh(+) i zbierz 10 μl krwi do 1 ml DPBS.
- Wybarwić komórki Rh+ fluorescencyjnym barwnikiem błony plazmatycznej. Opcjonalnie dodać 1 μl barwnika fluorescencyjnego do 1 ml zawiesiny komórek Rh+ (rozcieńczenie 1:1000).
- Inkubować komórki z barwnikiem fluorescencyjnym w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
- Granulować komórki, wirując w temperaturze 5,600 x g przez 15 s i umyć 3 razy przy użyciu 1 ml DPBS. Zawiesić w 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) z wapniem i magnezem (HBSS++).
- Za pomocą nakłuwacza jednym kliknięciem nakłuć palec dawcy Rh(-) i pobrać 2 μl krwi.
nuta: Jeśli przygotowujesz więcej niż 2 warunki, zbierz wystarczającą ilość krwi, aby dodać 1 μl krwi Rh(-) do każdej probówki.
- Przygotuj niezbędne probówki doświadczalne: same kulki, kontrola immunoglobuliny G (IgG), próbka.
- Same kulki: dodać 174 μl HBSS++, 1 μl kulek kontrolnych IgG, 1 μl kulek o dużej gęstości (1,2 g/ml) i 24 μl 500 mM Gd3+ (60 mM).
- Kontrola IgG: dodać 172 μl HBSS++, 1 μl kulek kontrolnych IgG, 1 μl kulek o dużej gęstości, 1 μl krwi Rh-, 1 μl barwionej zawiesiny krwi Rh+ i 24 μl 500 mM Gd3+.
- Do probówki z próbką dodać 172 μl HBSS++, 1 μl kulek powlekanych anty-RhD, 1 μl kulek o dużej gęstości, 1 μl krwi Rh-, 1 μl barwionej zawiesiny krwi Rh(+) i 24 μl 500 mM Gd3+,
nuta: Do próbek Rh dodaje się kulki o wysokiej gęstości w celach informacyjnych.
4. Analiza komórek w urządzeniu do lewitacji magnetycznej
- Uruchom przyrząd zgodnie z instrukcjami producenta.
- Załadować 50 μl próbki do rurki kapilarnej, aż probówka zostanie napełniona. Uszczelnij końce rurki kapilarnej uszczelniaczem kapilarnym, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
- Załaduj rurkę kapilarną do uchwytu między górnym i dolnym magnesem. Dostosuj scenę i ostrość, aby uzyskać optymalne viewing.
nuta: Komórki/kulki mogą potrzebować od 5 do 20 minut, aby osiągnąć pozycję równowagi magnetycznej w oparciu o ich gęstość i stężenie Gd3+. Im wyższe stężenieGd 3+, tym krótszy czas.