Technika in vitro do badania interakcji limfocytów T z obsługiwanymi płaskimi dwuwarstwami lipidowymi

Streszczenie

Źródło: Steblyanko, M., et al. Ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania tworzenia synaps immunologicznych między pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a wspieranymi dwuwarstwami lipidowymi (SLB). Białka powierzchniowe limfocytów T oddziałują z odpowiednimi ligandami unieruchomionymi na SLB, tworząc synapsę immunologiczną, po której następuje ruch granulek litycznych w kierunku synapsy, co jest wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Izolacja limfocytów T CD4⁺ do analizy obrazu

1. Rozmrozić 1 ml podwielokrotności zawierającej 10⁷ zamrożonych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) lub komórek jednojądrzastych węzłów chłonnych (LNMC) z pobranych próbek. W sterylnym kapturze dodaj rozmrożone komórki do 9 ml RPMI uzupełnionego penicyliną/streptomycyną i glutaminą.
   1. Odwirować komórki przez 10 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml uzupełnionego RPMI zawierającego 10% FBS (kompletna pożywka). Inkubować komórki przez noc w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C.
2. Następnego dnia należy oczyścić limfocyty T CD4⁺ metodą ujemnego sortowania immunomagnetycznego za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Aby zmierzyć liczbę świeżo oczyszczonych limfocytów T CD4⁺, należy zmieszać 5 μl zawiesiny komórek z równą objętością roztworu błękitu trypanowego. Załaduj hemocytometr mieszaniną niebieskiej komórki i trypana i policz żywe komórki w 5 sekcjach hemocytometru.
4. Weź średnią liczby komórek i określ liczbę komórek w oryginalnej zawiesinie komórek: liczba komórek/1 ml = średnia liczba x 2 x 10⁴. Jeśli łączna liczba wyizolowanych komórek jest zbyt mała, użyj komórek bez liczenia.
5. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić je w buforze testowym (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na₂HPO₄, 5 mM D-glukozy, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂ i 1% albuminy surowicy ludzkiej) przy 10 5 komórkach/50 μl lub mniej i utrzymywać komórki w temperaturze 4 °C (przez 1–2 godziny) do momentu, gdy będą gotowe do używać w eksperymentach.
6. Wszystkie odpady biologiczne należy utylizować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi.
7. Jeśli jest to pożądane jako populacja komórek kontrolnych, przygotuj aktywowane limfocyty T CD8 ⁺ z PBMC krwi pępowinowej, umieść 10⁷ komórek w 5 ml kompletnej pożywki w kolbie hodowlanej T25 pokrytej mieszaniną przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28 odpowiednio w stężeniu 10 μg / ml i 1 μg / ml.
8. Następnego dnia należy wyjąć aktywowane krwinki pępowinowe z kolby, przemyć je 1x świeżą kompletną pożywką i rozmnożyć komórki w obecności rekombinowanej IL-2 (100 U/ml) przez 2 tygodnie.
9. Oczyść limfocyty T CD8 ⁺ krwi pępowinowej przez ujemne sortowanie immunomagnetyczne przy użyciu dostępnego w handlu zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. Policz komórki i wymień pożywkę na bufor testowy, jak opisano w krokach 1.3–1.6 dla limfocytów T LN i PB CD8 ⁺.

2. Składniki do przygotowania płaskich dwuwarstw lipidowych

1. Przygotuj 3 rodzaje liposomów, jak opisano w innym miejscu: (a) 0,4 mM liposomów DOPC (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny), (b) 0,4 mM liposomy DOPC zawierające 33% mol. DOGS-NTA (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-[(N-(kwas 5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacenowy)sukcynylo] (sól amonowa)) lipidy, (c) 0,4 mM liposomy DOPC zawierające 4 mol% Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-(cap biotin) (sól sodowa)).
2. Przygotować 5% roztwór kazeiny, jak opisano wcześniej.
   1. Rozpuścić 5 g kazeiny w proszku w 100 ml ultraczystej wody i dodać 350 μl 10 M wodorotlenku sodu. Wymieszać wszystko na zwykłym mieszadle magnetycznym z małą prędkością zgodnie z dostępną skalą, w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie przez noc w temperaturze 4 °C. Dostosować pH do 7,3 i ultrawirować roztwór przez 2 godziny przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C. Przefiltrować supernatant sterylnym filtrem 0,22 μm i przechowywać roztwór w porcjach w temperaturze -80 °C.
      ostrożność: Roztwór wodorotlenku sodu może powodować oparzenia chemiczne i może wywołać trwałą ślepotę w kontakcie z oczami. Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną lub jej roztworami należy używać gumowych rękawic, odzieży ochronnej i ochrony oczu.
3. Oznacz przeciwciała anty-CD3 biotyną w celu wytworzenia monobiotynylowanych cząsteczek przeciwciał za pomocą wcześniej opisanego podejścia.
   1. Przygotować roztwór Biotyny-PEO4-NHS w dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 0,1 mg/ml. Dodać 3,7 μl roztworu Biotin-PEO4-NHS do 1 mg przeciwciała w 0,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 100 mM wodorowęglanu sodu.
   2. Inkubować mieszaninę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przygotować roztwór estru Alexa Fluor 488 NHS w stężeniu 10 mg/ml w DMSO. Dodaj roztwór estru Alexa Fluor 488 NHS do przeciwciała znakowanego przez Biotin-PEO4-NHS przy 10-krotnym nadmiarze molowym.
   3. Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, powoli mieszając na zwykłym mieszadle magnetycznym. Oddzielić niezwiązany barwnik za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.
   4. Oznaczyć stężenie przeciwciała, mierząc gęstość optyczną roztworu przeciwciała przy długości fali 280 nm (A280). Zmierzyć gęstość optyczną znakowanych przeciwciał przy długości fali 577 nm (A577).
   5. Określ stosunek barwnika do przeciwciała, korzystając z następującego równania:
      
      nuta: Dodatkowe informacje można znaleźć w protokole producenta.
4. Ekspresja rekombinowanego rozpuszczalnego białka Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) w systemie ekspresji Drosophila, jak opisano wcześniej.
   1. Sklonować, z kodowaniem cDNA, ektodomenę ICAM-1 do wektora ekspresyjnego Drosophila pMT / V5-His z indukowalnym promotorem metalotioneiny w celu wytworzenia rekombinowanego białka dołączonego do znacznika His6 na końcu C.
   2. Kotransfekcja komórek S2 z powstałym ICAM-1 zawierającym plazmid i wektor ekspresyjny genetycyny (G418). Wybierz stabilne transfektanty za pomocą pożywki Drosophila firmy Schneider uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i 0,5 mg/ml G418 przez 3 tygodnie. Rozmnoż komórki w pożywce dla owadów bez surowicy i indukuj ekspresję białka za pomocą 0,5 mM CuSO₄ przez 3 dni.
   3. Zagęścić supernatant hodowli 10x i dializować w stosunku do PBS za pomocą koncentratora przepływu stycznego, jak opisano wcześniej.
   4. Nałożyć skoncentrowany supernatant hodowli na kolumnę zawierającą Sepharose z kowalencyjnie unieruchomionym przeciwciałem monoklonalnym anty-ICAM-1 i eluować związany ICAM-1 za pomocą 50 mM buforu glicynowego o pH 3,0. Natychmiast zneutralizować eluowane białko ICAM-1 za pomocą 2 M buforu Tris o pH 8,0.
   5. Zdeluzowany materiał należy dializować w stosunku do PBS, pH 8,0 i dodać dializowany materiał do kolumny zawierającej agarozę Ni-NTA (kwas niklowo-nitrylooctowy). Eluować rozpuszczalny ICAM-1 z 200 mM imidazolem, pH 8,0. Uwolniony materiał należy dializować w buforze PBS o pH 8,0.
   6. Oznaczyć oczyszczony ICAM-1 estrem N-hydroksysukcynimidu cyjaniny 5 (Cy5 NHS) zgodnie z instrukcjami producenta.
      nuta: Najlepszy końcowy stosunek barwnika do białka wynosi 1:1.
5. Wytworzyć fragmenty Fab z przeciwciała anty-CD107a przez trawienie papainą i oczyścić fragmenty Fab za pomocą chromatografii jonowymiennej, jak opisano wcześniej. Oznacz fragmenty Fab estrem Alexa Fluor 568 NHS zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Tworzenie dwuwarstwowych płaskich warstw lipidowych na podłożu szklanym

1. Przygotuj świeży kwaśny roztwór piranii, mieszając 140 ml stężonego kwasu siarkowego i 60 ml 30% nadtlenku wodoru. Umyj szklane szkiełka nakrywkowe do szkiełek przepływowych, mocząc je w kwaśnym roztworze piranii przez 30 minut. Przytrzymaj szklane szkiełko nakrywkowe za pomocą polipropylenowych kleszczyków nożycowych.
   ostrożność: Roztwór piranii jest niezwykle silnym utleniaczem. Pamiętaj, aby podczas pracy z roztworem zawsze nosić okulary lub gogle ochronne lub osłonę pełnotwarzową wraz z grubymi gumowymi rękawicami. Pracuj tylko z roztworem piranii pod wyciągiem. Unikaj podgrzewania, transportu lub potrząsania nim w dowolnym momencie podczas użytkowania, ponieważ może eksplodować. Zbierz odpady piranii do szklanej butelki z otworem zawierającym ołów. Skontaktuj się z Instytucjonalnym Komitetem ds. Bezpieczeństwa w sprawie prawidłowego utylizacji odpadów.
2. Umyte szkiełka nakrywkowe spłukać 7x ultraczystą wodą, przenosząc je kolejno do zlewek zawierających świeżą wodę. Odłóż mokre szkiełka nakrywkowe na bok, aby pozostała woda stoczyła się z czystej szklanki, pozostawiając suchą szklankę.
   1. Alternatywnie użyj końcówki pipety dołączonej do pompy próżniowej, aby ostrożnie usunąć pozostałe kropelki wody z szkiełek nakrywkowych.
3. W sterylnym kapturze wykonaj rozcieńczenia różnych lipidów, aby wytworzyć mieszankę liposomów do tworzenia dwuwarstw. Najpierw połącz 37 μl liposomów DOPC i 3 μl liposomów Biotinyl-Cap-PE. Po drugie, wymieszaj 14 μl liposomów DOPC i 15 μl liposomów DOGS-NTA. Po trzecie, dodaj 1 μl pierwszej mieszanki do 29 μl drugiej mieszanki, aby wytworzyć końcową mieszaninę liposomów.
4. W sterylnym kapturze przygotuj miejsce do pracy z suchymi szkiełkami nakrywkowymi w pobliżu. Podwielokrotność 2 μl końcowej mieszaniny liposomów (patrz krok 3.3) dokładnie w środku samoprzylepnego kanału ślizgowego. Natychmiast i bardzo precyzyjnie wyrównaj czyste i suche szkiełko nakrywkowe ze szkiełkiem podstawowym i delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na lepką stronę szkiełka.
   1. Jeśli przygotowujesz więcej niż jedno szkiełko, pracuj na jednym szkiełku na raz, ponieważ mieszanina liposomów szybko odparowuje. Odwróć suwak i użyj zewnętrznego pierścienia polipropylenowych kleszczyków nożycowych, aby delikatnie docisnąć obwodowy kontakt szkiełka nakrywkowego ze szkiełkiem, upewniając się, że szkiełko jest mocno przymocowane do szkiełka, aby wykluczyć wyciek.
      nuta: Nie naciskaj na kanały szkiełka, aby uniknąć złamania lub pęknięcia szkiełka nakrywkowego.
   2. Ponownie odwróć szkiełko i zaznacz położenie uformowanej dwuwarstwy, która wygląda jak kropla między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem kanałowym, rysując 4 kropki trwałym markerem wokół dwuwarstwy po zewnętrznej stronie suwaka zespołu.
5. Przed pierwszym wstrzyknięciem cieczy do kanału należy wyznaczyć jeden port kanału jako port wejściowy, a drugi jako port wyjściowy i utrzymywać to oznaczenie przez cały czas trwania eksperymentu.
6. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, włóż końcówkę końcówki pipety bezpośrednio do portu wejściowego kanału. Powoli napełnić kanały szkiełka 50 μl ciepłego (co najmniej w temperaturze pokojowej) buforu do oznaczania (patrz krok 1.5 w celu zapoznania się ze składem buforu).
7. Przygotować 0,5 M roztwór chlorku niklu(II). Rozmrozić 2 ml roztworu kazeiny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut i uzupełnić go roztworem chlorku niklu o końcowym stężeniu 200 μM.
8. Przemyć dwuwarstwy, najpierw wstrzykując 100 μl roztworu kazeiny do portu wejściowego kanału, a następnie natychmiast usuwając 100 μl z portu wyjściowego na szkiełku przez pipetowanie. Zablokować dwuwarstwy tym samym roztworem, wstrzykując 100 μl roztworu kazeiny do portu wejściowego każdego kanału i inkubując szkiełko przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
9. Rozmrozić podwielokrotności białek Cy5-ICAM-1-His₆ i streptawidyny. Połączyć białka w buforze do oznaczania o końcowym stężeniu 2 μg/ml każde. Odwirowywać roztwór przez 30 minut w temperaturze 20 000 x g i temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich osadów.
10. Usunąć pozostałą część roztworu blokującego z portu wyjściowego kanału szkiełkowego za pomocą pipetowania. Wstrzyknąć 100 μl roztworu zawierającego ICAM-1 i streptawidynę do portu wejściowego.
11. Inkubować szkiełko przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć nadmiar roztworu białkowego z portu wyjściowego. Przemyć dwuwarstwę 2x, najpierw wstrzykując 100 μl buforu testowego do portu wejściowego kanału, a następnie natychmiast usuwając 100 μl z portu wyjściowego.
12. Rozcieńczyć przeciwciało anty-CD3 znakowane Alexa-Fluor-488 buforem testowym do końcowego stężenia 2 μg/ml. Wstrzyknąć 100 μl roztworu przeciwciała do portu wejściowego szkiełka i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć nadmiar roztworu białkowego z portu wyjściowego. Przemyć dwuwarstwę 2x 100 μl buforu do oznaczania, jak w kroku 3.11.

4. Obrazowanie interakcji limfocytów T z dwuwarstwą planarną

1. Rozgrzej stolik i obiektyw mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu fluorescencji z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF), aż temperatura osiągnie równowagę na poziomie 37 °C. Ustaw szkiełko z dwuwarstwą (warstwami) na podgrzewanym stoliku. Przesuń stolik do odpowiedniej pozycji zgodnie ze śladami atramentu i skup się na dwuwarstwie wykorzystującej fluorescencję cząsteczek ICAM-1 znakowanych Cy.
   1. Użyj obiektywu 61X do mikroskopu konfokalnego lub obiektywu 100X do mikroskopu TIRF, z odpowiednimi ustawieniami filtrów.
2. W celu obrazowania uwalniania granulek za pomocą mikroskopii TIRF, przed wstrzyknięciem komórek do portów wejściowych dodać fragmenty Fab przeciwciała anty-CD107a znakowane Alexa-Fluor-568 do zawiesiny komórkowej w końcowym stężeniu 4 μg/ml.
   1. Zawiesić przygotowane limfocyty T CD4⁺ wyizolowane z LN PB lub krwi pępowinowej i wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej do portu wejściowego kanału szkiełkowego zawierającego dwuwarstwę.
3. Wybierz żądaną liczbę pól i rejestruj obrazy każdego pola 1x co 2 minuty przez 30 minut po wstrzyknięciu.
4. Wykorzystaj jasne pole, światło odbite i kanały fluorescencyjne (Alexa 488 i Cy5) mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać obrazy. Użyj trybu TIRF dla fluorescencji Alexa-Fluor-488 i Alexa-Fluor-568 oraz szerokiego pola dla fluorescencji Cy5, a także obrazowania w jasnym polu na mikroskopie TIRF.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do izolacji limfocytów T CD4, ludzki	Miltenyl Biotec	tel. 130-096-533
Zestaw do izolacji limfocytów T CD8, ludzki	Miltenyl Biotec	Numer katalogowy: 130-096-495
DOPC (Protokół DOPC	Lipidy polarne Avanti	850375C
PSY NTA	Lipidy polarne Avanti	790528C
Czapka Biotinyl PE	Lipidy polarne Avanti	870273C
Albumina surowicy ludzkiej	Octapharma Stany Zjednoczone	NDC 68982-643-01
lepki-Slajd VI 0.4	ibidi	Numer katalogowy: 80608
Szkiełka nakrywkowe do szkiełek samoprzylepnych	ibidi	Numer katalogowy: 10812
Komora Bioptech FCS2	Technologia biologiczna	Numer katalogowy: 060319-2-03
anty-CD3	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 16-0037-81	Klon OKT3, komórki hybrydoma są dostępne w ATCC
przeciwciało anty-CD28	Genetex	GTX14664	9.3 klon
kazeina	Sigma	Zobacz materiał C5890
Biotyna-PEO4-NHS	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 21329
Dmso	Sigma	D2650-5
Zestaw do znakowania białek Alexa Fluor 488 z kolumną do oczyszczania znakowanych białek	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. A10235
Zestaw do znakowania białek Alexa Fluor 568 z kolumną do oczyszczania znakowanych białek	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. A10238
Amersham Cy5 NHS Ester	GE Nauki przyrodnicze	PA15101
pMT/V5-Wektory ekspresji HIS A, B, C Drosophila	Thermo Fisher Naukowy	V412020
pcopneo, G418 Wektor ekspresji Drosophila do selekcji pozytywnej	Kontroler ATCC (Kontroler T	Numer katalogowy: 37409
Bez surowicy Drosophial media Insect-XPRESS	Lonza	12-730Q
Hybrydoma YN1/1.7.4	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL1878	Hybrydoma wydziela przeciwciało przeciwko ICAM-1.
Sefaroza aktywowana bromkiem cyjanu 4B	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C9142	Służy do przygotowania sefalozy z silnie związanym przeciwciałem anty-ICAM.
Koncentrator przepływu stycznego MasterFlex	Cole'a-Parmera	Nr kat. 77601-60 7592-40	Stosowany do koncentracji supernatantu zawierającego ICAM-1 i dializy ICAM-1 zawierającego supernant
Centramate Lab Systemy przepływu stycznego	Laboratorium Pall	FS002K10 OS010T12 FS005K10	Stosowany do koncentracji supernatantu zawierającego ICAM-1 i dializy ICAM-1 zawierającego supernant
Ni-NTA Agaroza	QIAGEN powiedział:	Numer katalogowy: 30210
Rurki do dializy	Spectra/Por	131384
Papaina z lateksu papai	Sigma	Zobacz materiał P3125
mysie przeciwciało anty-ludzkie przeciwko CD107a	BD Bioscences	555798	Klon H4A3
Rękawice Ansell w kolorze naturalnego niebieskiego	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 19-014-539
Kleszcze nożycowe z polipropylenu Nalgene	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. 6320-0010
Streptawidyna	ProZyme	Zobacz materiał SA10
Mikroskop konfokalny	Nikon		Mikroskop odwrócony Nikon TiE wyposażony w PFS do długoterminowej kontroli stabilności obrazu, obiektywy olejowe 60x, 4 lasery z liniami wzbudzenia przy 405, 458, 488, 514, 561 i 640 nm, 2 detektory GaAsP i 2 PMT o wysokiej czułości, światło przechodzące DIC, programowalny stolik X,Y,Z do wielu pozycji i łączenia dużych obszarów, funkcje poklatkowe, Komora Tokai-Hit z kontrolowaną temperaturą i CO2 do obrazowania na żywo oraz stół z izolacją antywibracyjną
Mikroskop TIRF	Andor		System Andor Revolution XD wyposażony w oświetlacz Nikon TIRF-E, lasery z liniami 405,488,561 i 640, światło przechodzące DIC, głowicę dysku obrotowego Yokogawa CSU-X1 do obrazowania konfokalnego, obiektyw 100/1,49 NA, kamerę EM-CCD Andor iXon X3, grzałkę obiektywową oraz piezoelektryczny stolik z napędem silnikowym z systemem Perfect Focus (PFS)