Wpływ immunomodulującego środka farmakologicznego na interakcję między komórkami dendrytycznymi a limfocytami T CD4+

Streszczenie

Źródło: Wei, H., et al. Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych. J. Vis. Exp. (135), (2018).

Ten film demonstruje metodę przekształcania komórek dendrytycznych (DC) w tolerogenne DC (TolDCs) za pomocą immunomodulującego środka farmakologicznego. Konwersja ta jest potwierdzana przez ocenę funkcji TolDC poprzez ich immunosupresyjne działanie na limfocyty T CD4 +.

Protokół

1. Oceń funkcję TolDC in vitro i in vivo

1. Test proliferacji syngenicznej komórek T
   1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawowania i przeprowadź eksperyment w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.
   2. Przygotować bufor MACS przy użyciu 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA w 500 ml PBS. Wysterylizuj bufor, filtrując przez filtr 0,2 μm.
      nuta: Trzymaj bufor na lodzie podczas następnego eksperymentu.
   3. Aby uzyskać limfocyty T CD4 +, należy poddać eutanazji transgeniczne myszy z receptorem komórek T OT-II (TCR) w wieku 8-10 tygodni za pomocą komory CO₂. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spłucz 70% etanolem. Odizoluj śledzionę od lewej strony brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
   4. Umieścić śledzionę z 2 ml PBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm i użyć tylnej części popychacza strzykawki o pojemności 3 ml do rozdrobnienia śledziony, przepuszczając sitko do komórek o wielkości 40 μm.
   5. Zebrać zawiesinę komórkową i wirować przy 300 x g przez 5 minut.
   6. Zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu MACS.
   7. Dodaj 100 μl koktajlu biotyny i przeciwciał z limfocytów T CD4+ w temperaturze 4°C przez 5 minut.
      nuta: Koktajl przeciwciał wiąże się z innymi typami komórek z wyjątkiem limfocytów T CD4 +, takich jak CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC klasy II, Ter-119 i TCRγ / δ.
   8. Dodać 300 μl buforu MACS i 200 μl kulek antybiotyny (tabela materiałów) w temperaturze 4°C przez 10 minut.
   9. Umieścić kolumnę złożoną z kulek ferromagnetycznych (tabela materiałów) i filtra do wstępnej separacji w polu magnetycznym i przepłukać ją 3 ml buforu MACS.
   10. Dodać 9 ml buforu MACS do komórek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
   11. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu MACS i nałożyć go na kolumnę. Zbierz przepływowe limfocyty T CD4 +.
   12. Przemyć kolumnę kolejnymi 3 ml buforu MACS, a także zebrać przepływ.
   13. Aby uzyskać DC śledziony, należy poddać eutanazji myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni za pomocą komory CO₂. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spłucz 70% etanolem. Odizoluj śledzionę od lewej strony brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy. Umieść śledzionę w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm, zawierającym 2 ml roztworu kolagenazy D (2 mg/ml kolagenazy D rozpuszczonej w HBSS zawierającej wapń i magnez).
   14. Wstrzyknąć 1 ml roztworu kolagenazy D do śledziony dwa razy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 25G. Pokrój śledzionę na małe kawałki małymi nożyczkami.
   15. Wstrząśnij i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
   16. Dodaj 500 μl 0,5 M EDTA w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
       nuta: Kroki od 1.1.13-1.1.14 mają kluczowe znaczenie dla zwiększenia wydajności DC.
   17. Następnie użyj tylnej części popychacza strzykawki o pojemności 3 ml, aby zmielić zawiesinę śledziony, przepuszczając sitko do komórek o wielkości 40 μm i zebrać zawiesinę komórek, wirując przy 300 x g przez 5 minut.
   18. Zawiesić osad komórkowy w 350 μl buforu MACS, 50 μl odczynnika blokującego FcR i 100 μl koktajlu biotyny i przeciwciał z komórek dendrytycznych Pan Dendritic w temperaturze 4°C przez 10 minut.
       nuta: Koktajl przeciwciał przeciwko antygenom, które nie są eksprymowane przez DC.
   19. Przemyć komórki, dodając 9 ml buforu MACS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
   20. Zawiesić osad komórkowy w 800 μl buforu MACS i dodać 200 μl kulek antybiotyny w temperaturze 4°C na 10 minut.
   21. Powtórz kroki z 1.1.9-1.1.11, aby zebrać kontrolery domeny.
   22. Przemyć kolumnę kolejnymi 3 ml buforu MACS dwa razy i również zebrać przepływ.
   23. Traktować 2 x 10⁵ DCs/ml w obecności lub braku 100-400 nM CDDO-DFPA w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Oddzielnie oznaczyć limfocyty T CD4 + (1 x 10⁷ / ml) 1 μM CFSE w temperaturze 37 ° C przez 15 minut, przemyć PBS i ponownie dostosować objętość, aby uzyskać końcowe stężenie na poziomie 2 x 10⁶ limfocytów T / ml.
   24. Następnie, na 96-dołkowej płytce, należy wspólnie wyhodować 100 μl traktowanych komórek dendrytycznych z tą samą objętością komórek T CD4 + znakowanych CFSE, oba pobrane z powyższych kroków, aby uzyskać stosunek 1:10. Teraz dodaj 100 ng / ml peptydu albuminy jaja kurzego (OVA) 323-329 na dołek i zmierz intensywność CFSE limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej po 2-3 dniach inkubacji.
       nuta: Liczba komórek i stosunek komórek DC i T zostały zoptymalizowane w stosunku do naszych poprzednich prac.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CDDO-DFPA (RTA-408)	Reata Pharmaceuticals	Synteza we własnym zakresie	Hodowla komórkowa
Mysz GM-CSF	Peprotech Inc	315-03	Zróżnicowanie BMDC
Zestaw do izolacji komórek dendrytycznych Pan	Miltenyi Biotec Inc.	Numer katalogowy: 130-100-875	Test proliferacji limfocytów T
Koktajl biotyny i przeciwciał z komórek dendrytycznych Pan	Miltenyi Biotec Inc.	Numer katalogowy: 130-100-875	Test proliferacji limfocytów T
Zestaw do izolacji limfocytów T CD4+	Miltenyi Biotec Inc	130-104-454	Test proliferacji limfocytów T
Międzynarodowa Federacja Piłki	Legenda biologiczna	423801	Test proliferacji limfocytów T
Odczynnik blokujący FcR	Miltenyi Biotec Inc.	Numer katalogowy: 130-100-875	Test proliferacji limfocytów T
Mikrogranulki antybiotynowe	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	Test proliferacji limfocytów T
Strzykawka 1 ml	BD Nauki biologiczne	309626	Test proliferacji limfocytów T
Bsa	Sigma Aldrich Inc	Certyfikat A2058	Test proliferacji limfocytów T
Edta	ThermoFisher Naukowy	15575020	Test proliferacji limfocytów T
Kolumna LS	Miltenyi Biotec Inc.	Numer katalogowy: 130-042-401	Test proliferacji limfocytów T
Filtr wstępnej separacji	Miltenyi Biotec Inc	Numer katalogowy: 130-095-823	Test proliferacji limfocytów T
Kolagenaza D	Sigma Aldrich Inc.	11088858001	Test proliferacji limfocytów T
HBSS (Sieć HBSS)	ThermoFisher Naukowy	14025076	Test proliferacji limfocytów T
Peptyd albuminy jaja kurzego (OVA) 323–329	Sigma Aldrich Inc.	Numer katalogowy O1641	Test proliferacji limfocytów T