Technika in vitro do wizualizacji egzocytozy granulek wydzielniczych w komórkach tucznych

Streszczenie

Źródło: Klein, O., et al. Obrazowanie FITC-dekstranu jako reportera regulowanej egzocytozy J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje technikę wizualizacji egzocytozy w komórkach tucznych. Komórki są inkubowane z dekstranem FITC - fluorescencyjnym reporterem - który jest pobierany przez komórki wewnątrz granulek wydzielniczych (SG), gdzie kwaśne pH wygasza jego fluorescencję. Po stymulacji egzocytozy ziarnistości, wyższe pH pożywki indukuje fluorescencję reporterową wewnątrz stopionych SG, która jest wizualizowana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Protokół

1. Przygotowania

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej RBL (RBL-2H3 mastucyjnej linii komórkowej)
   1. Wymieszaj 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 56 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5,5 ml roztworu penicyliny, streptomycyny i nystatyny, 5,5 ml roztworu L-glutaminy 200 mM. Powoduje to DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełnionym 10% FBS, 100 μg / ml streptomycyny, 100 jednostek / ml penicyliny, 12 jednostek / ml nystatyny i 2 mM L-glutaminy.
   2. Przefiltrować media za pomocą filtra próżniowego o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Utrzymanie komórek RBL.
   1. Wyhoduj komórki RBL do maksymalnej konfluencji 90% w 10 cm naczyniu. Jeśli hodowla komórkowa jest zdrowa, komórki powinny mieć kształt wrzeciona z okazjonalnymi wypukłościami.
   2. W celu rozszczepienia komórek należy odłączyć komórki od naczynia, zasysając pożywkę i zastępując ją 2 ml roztworu B. Inkubować przez 5-10 minut w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
   3. Po odłączeniu komórek zneutralizuj trypsynę, dodając 2 ml pożywki hodowlanej za pomocą pipety i podziel komórki w stosunku 1:2 - 1:10.
3. Przygotowanie bufora 20x Tyrode
   1. Przygotuj podstawowy 20-krotny roztwór 54 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 2,74 M NaCl i 8 mM NaH₂PO₄ w wodzie podwójnie destylowanej (DDW). Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Hodowla komórek RBL do mikroskopii żywych komórek

1. Przygotowanie roztworu FITC-dekstranu.
   1. Zmieszać 1 mg sproszkowanego izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu (150 K) na 1 ml pożywki hodowlanej (patrz krok 1.1.1). Aby uzyskać pełnokomorową szklankę nakryciową, przygotuj 3 ml.
   2. Używając jednostki filtrującej strzykawkę z octanu celulozy o wielkości porów 0,22 μm, przefiltruj rozpuszczony dekstran FITC.
   3. Dodać mysią immunoglobulinę E (IgE) do stężenia 1 μg/ml.
2. Wysiewanie komórek RBL do obrazowania
   1. Dzień przed obrazowaniem odessać pożywkę z szalki hodowlanej i zastąpić ją 2 ml roztworu B. Inkubować przez 5 - 10 minut w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Po odłączeniu komórek zneutralizuj trypsynę, dodając 2 ml pożywki hodowlanej.
   2. Policz komórki RBL za pomocą hemocytometru i odpowiednio dostosuj objętość za pomocą pożywki hodowlanej, aby uzyskać stężenie komórek 7,5 x 10⁵ / ml.
   3. Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej do komorowego szkła nakrywkowego wstępnie wypełnionego świeżą pożywką hodowlaną uzupełnioną dekstranem FITC-dekstran (w wyniku czego w komorze wysiewa się 7,5 x 10³ komórek).
   4. Hodować komórki RBL przez noc w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Komórki powinny pozostać na poziomie sub-konfluencji, aby upewnić się, że komórki są oddzielone i że łatwo jest zidentyfikować każdą komórkę indywidualnie pod mikroskopem.
3. Transfekcja komórek RBL - opcjonalnie.
   1. Aby zobrazować zdarzenia egzocytarne w połączeniu z innymi fluorescencyjnie znakowanymi białkami, zobacz protokół transfekcji dla komórek RBL w Azouz i wsp.

3. Mikroskopia żywych komórek egzocytozy

1. Przygotowanie roztworów:
   1. Przygotować końcowy roztwór buforowy Tyrode'a, rozcieńczając roztwór podstawowy w DDW w rozcieńczeniu 1:20 i uzupełnić 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl₂, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5,6 mM glukozy.
   2. Świeżo przygotuj 20-krotny odczynnik sekretagogiczny w buforze Tyrode'a [1 μg/ml dinitropfenylu sprzężony z albuminą surowicy ludzkiej (DNP-HAS (Ag)) w naszym przypadku, dla stężenia 50 ng/ml 1x].
   3. Przygotować roztwór chlorku amonu o stężeniu 400 mM, rozpuszczając proszek w buforze Tyrode'a.
2. Przygotowanie komórek.
   1. Umyj nakrycie z komorą 3 razy, odsysając pożywkę z komory i ponownie napełniając ją 300 μl buforu Tyrode, podgrzanego do temperatury 37 °C. Na koniec uzupełnij komorę 300 μl buforu Tyrode, podgrzanego do 37 °C.
   2. Umieść szklaną pokrywę z komorą w komorze inkubatora mikroskopu. Upewnij się, że komora jest stabilna.
3. Ustawianie mikroskopu
   1. Aby wybrać obszar zainteresowania do śledzenia, włącz fluorescencyjne źródło światła (tradycyjnie lampę rtęciową) i wybierz odpowiedni filtr fluorescencyjny (wybierz filtr dla zielonych fluoroforów do oglądania FITC-dstranu). Gdy obszar zainteresowania jest ostry i znajduje się w środku pola widzenia, wyłącz źródło światła, aby uniknąć fotowybielania i toksyczności.
      UWAGA: Część dekstranu FITC-wbudowanego w komórki może zachować fluorescencję. Dzieje się tak, ponieważ dekstran FITC może być również sortowany do przedziałów nielizosomalnych, takich jak endosomy.
   2. Włącz odpowiednie oświetlenie do wzbudzenia FITC. Jeśli używasz mikroskopu laserowego, włącz laser o długości fali 488 nm. Emisja powinna być zgromadzona w okolicach 500 - 550 nm (szczyt emisji FITC przy 510 - 520 nm).
   3. Podczas korzystania z mikroskopu konfokalnego otwórz otwór do maksimum. Pozwoli to na użycie mniejszej mocy lasera, aby uniknąć bielenia i toksyczności oraz zapewni wychwycenie zdarzeń egzocytozy ze wszystkich płaszczyzn komórki.
   4. Skalibruj odstęp czasu między akwizycjami obrazu.
      1. Różne komórki mogą różnić się kinetyką regulowanej egzocytozy. W przypadku specyficznego obrazowania egzocytozy złożonej zalecamy odstęp czasu wynoszący co najmniej 5 sekund. Jednak z reguły, aby umożliwić szybkie obrazowanie, upewnij się, że czas akwizycji pojedynczej klatki jest krótki.
      2. Korzystając z laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, ustaw kierunek skanowania na dwukierunkowy, nie dopuszczaj do uśredniania i ustaw rozdzielczość na 512 x 512 (zalecane; dwa ostatnie przepisy pomogą również zminimalizować bielenie i toksyczność).
4. Obrazowanie egzocytozy.
   1. Obrazuj komórki przez żądany czas trwania, w zależności od typu komórki lub sekretagogii. W komórkach RBL wyzwalanych IgE/Ag większość zdarzeń egzocytarnych występuje w ciągu 15 - 20 minut od aktywacji.
   2. W celu aktywacji komórek dodaj do komory 16 μl z 20x roztworu wydzielającego.
5. Potwierdzenie obecności FITC-dekstranu w komórkach.
   1. Aby potwierdzić obecność i lokalizację FITC-dekstranu w SGs, delikatnie dodaj 16 μl roztworu chlorku amonu (należy uważać, aby nie przesunąć komory, aby nie stracić ostrości) do komory (uzyska to końcowe stężenie 20 mM). Spowoduje to alkalizację SG i wygaszenie fluorescencji FITC, co nastąpi w ciągu kilku sekund.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM niski poziom glukozy	Indukcje biologiczne	01-050-1A
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 12657
Roztwór pióra-paciorkowca-nystatyny	Indukcje biologiczne	03-032-1B
L-Glutamina 200 mM roztwór	Indukcje biologiczne	03-020-1A
Dekstran FITC 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsyna/EDTA, roztwór B	Indukcje biologiczne	03-052-1A	Przed użyciem podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C
Filtr górno-próżniowy o wielkości porów 0,22 μm	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Strzykawka filtrująca z octanu celulozy, wielkość porów 0,22 μm	Sartorius Sartorius (Wyspa	Numer katalogowy: 16534 tys.
Szklana osłona komorowa	Termo naukowy	155411
Naczynia hodowlane poddane kulturze tkankowej Corning	Sigma-Aldrich	CLS430167
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A4503 (wersja angielska
Przeciwciała monoklonalne IgE anty-DNP	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	Nr kat. A6661	Unikaj bezpośredniej ekspozycji na światło
Hepes bufor 1M, pH 7,4	Indukcje biologiczne	03-025-1B
CaCl2	Merk	102382
glukoza	Laboratoria BDH	284515V
Chlorek amonu	Merk	1145
RURY sól dipotasowa	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy 108321-27-3
Hydrat octanu wapnia	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 114460-21-8
Octan magnezu czterowodny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M5661
Glutaminian potasu (kwas L-glutaminowy, sól potasowa jednowodna)	Sigma-Aldrich	Klasa G1501
NaH2PO4	Merk	Numer katalogowy: 6346
Zawartość NaCl	Merk	106404
MgCl2	Merk	105833
Kcl	Merk	104936
Elektroporator	Karta BTX (BTX)	Sterownik ECM830
Mikroskop konfokalny, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Użyte na rysunku 3. Wyposażony w elektroniczną regulację temperatury
inkubator ze strumieniem powietrza
Mikroskop konfokalny, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Użyte na rysunku 2. Wyposażony w detektor GaAsP, elektroniczną kontrolę temperatury
inkubator ze strumieniem powietrza
Mikroskop konfokalny, Leica	Księga Leica	Dodatek SP5	Użyte na rysunku 1. Wyposażony w detektor Leica HyD i inkubator najwyższego stopnia (okolab)
Ogniwa RBL-2H3			Komórki RBL-2H3 sklonowano w laboratorium Reubena P. Siraganiana. Patrz odnośnik 67

Sar ) szt.