Technika in vitro do wizualizacji egzocytozy granulek wydzielniczych w komórkach tucznych

Streszczenie

Źródło: Klein, O., et al. Obrazowanie FITC-dekstranu jako reportera regulowanej egzocytozy J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje technikę wizualizacji egzocytozy w komórkach tucznych. Komórki są inkubowane z dekstranem FITC - fluorescencyjnym reporterem - który jest pobierany przez komórki wewnątrz granulek wydzielniczych (SG), gdzie kwaśne pH wygasza jego fluorescencję. Po stymulacji egzocytozy ziarnistości, wyższe pH pożywki indukuje fluorescencję reporterową wewnątrz stopionych SG, która jest wizualizowana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Protokół

1. Przygotowania

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej RBL (RBL-2H3 mastucyjnej linii komórkowej)
   1. Wymieszaj 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 56 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5,5 ml roztworu penicyliny, streptomycyny i nystatyny, 5,5 ml roztworu L-glutaminy 200 mM. Powoduje to DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełnionym 10% FBS, 100 μg / ml streptomycyny, 100 jednostek / ml penicyliny, 12 jednostek / ml nystatyny i 2 mM L-glutaminy.
   2. Przefiltrować media za pomocą filtra próżniowego o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Utrzymanie komórek RBL....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM niski poziom glukozy	Indukcje biologiczne	01-050-1A
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 12657
Roztwór pióra-paciorkowca-nystatyny	Indukcje biologiczne	03-032-1B
L-Glutamina 200 mM roztwór	Indukcje biologiczne	03-020-1A
Dekstran FITC 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsyna/EDTA, roztwór B	Indukcje biologiczne	03-052-1A	Przed użyciem podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C
Filtr górno-próżniowy o wielkości porów 0,22 μm	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Strzykawka filtrująca z octanu celulozy, wielkość porów 0,22 μm	Sartorius Sartorius (Wyspa	Numer katalogowy: 16534 tys.
Szklana osłona komorowa	Termo naukowy	155411
Naczynia hodowlane poddane kulturze tkankowej Corning	Sigma-Aldrich	CLS430167
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A4503 (wersja angielska
Przeciwciała monoklonalne IgE anty-DNP	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	Nr kat. A6661	Unikaj bezpośredniej ekspozycji na światło
Hepes bufor 1M, pH 7,4	Indukcje biologiczne	03-025-1B
CaCl2	Merk	102382
glukoza	Laboratoria BDH	284515V
Chlorek amonu	Merk	1145
RURY sól dipotasowa	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy 108321-27-3
Hydrat octanu wapnia	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 114460-21-8
Octan magnezu czterowodny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M5661
Glutaminian potasu (kwas L-glutaminowy, sól potasowa jednowodna)	Sigma-Aldrich	Klasa G1501
NaH2PO4	Merk	Numer katalogowy: 6346
Zawartość NaCl	Merk	106404
MgCl2	Merk	105833
Kcl	Merk	104936
Elektroporator	Karta BTX (BTX)	Sterownik ECM830
Mikroskop konfokalny, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Użyte na rysunku 3. Wyposażony w elektroniczną regulację temperatury
inkubator ze strumieniem powietrza
Mikroskop konfokalny, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Użyte na rysunku 2. Wyposażony w detektor GaAsP, elektroniczną kontrolę temperatury
inkubator ze strumieniem powietrza
Mikroskop konfokalny, Leica	Księga Leica	Dodatek SP5	Użyte na rysunku 1. Wyposażony w detektor Leica HyD i inkubator najwyższego stopnia (okolab)
Ogniwa RBL-2H3			Komórki RBL-2H3 sklonowano w laboratorium Reubena P. Siraganiana. Patrz odnośnik 67

Sar ) szt.