$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Koniugacja antygenu białkowego z pegylowanym lipidem
- Dodać 3 g usieciowanych kulek żelu dekstranowego o zakresie frakcjonowania 1 500–30 000 daltonów (Da) do kolby próżniowej o pojemności 250 ml. Dodać 60 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ciągle mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego. Uszczelnić kolbę i podłączyć ją do próżni, aby rozpocząć odgazowywanie na płytce mieszającej przez co najmniej 1 godzinę.
- W szklanej kolumnie chromatograficznej o wymiarach 1,0 cm x 30 cm z zamkniętym korkiem obrotowym dodać PBS do kolumny w celu przemycia. Otwórz korek obrotu i opróżnij kolumnę. Po umyciu dodaj do kolumny gnojowicę z odgazowanych kulek. Ciągle dodawaj gnojowicę, aż kolumna zostanie upakowana do wysokości około 24 cm.
- Gdy kolumna będzie miała "główkę" około 4–5 cm PBS nad upakowanymi kulkami, przygotuj następujące kroki.
- Utwórz syfon przepływu grawitacyjnego, mierząc kawałek rurki wystarczająco długiej, aby dotrzeć do półki 1–2 stopy nad górną częścią kolumny i utwórz pętlę, która opada w pobliżu dolnej części kolumny i wraca na górę kolumny. Dodaj korek obrotowy do jednego końca rurki, pozostawiając jedną stronę rurki otwartą. Umieść otwarty koniec probówki w butelce PBS o pojemności 500 ml i umieść go na półce nad kolumną.
- Weź koniec z korkiem obrotowym i podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml. Otwórz zawór zatrzymujący obrót na przewodzie rurowym i przeciągnij PBS przez rurkę. Gdy PBS dotrze do trzech czwartych drogi przez rurkę, szybko wyjmij strzykawkę i dodaj korek obrotowy do górnej części kolumny — płyn powinien spływać na kolumnę.
UWAGA: Ilość "głowy" PBS pozostawiona na górze kolumny powinna wynosić od 1 do 3 cm. Minimalna ilość do umycia kolumny to 3 objętości kolumny.
- Określ ilość białka (moli), które ma być połączone z lipidami, na podstawie jego masy cząsteczkowej (MW).
UWAGA: Fragment Fab koziej immunoglobuliny anty-mysjej, IgM (sama w sobie IgG) jest tutaj używany jako uniwersalny antygen zastępczy do poliklonalnej stymulacji komórek B. W związku z tym fragment Fab koziej IgG ma MW około 48 kilodaltonów (kDa) i jest dostępny w handlu w całkowitej ilości 1,3 mg. Zatem ilość białka do połączenia wynosi 27,1 μmol.
- Określ współczynnik ekstynkcji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jeżeli nie jest znana, zmierzyć absorbancję białka przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru i podzielić wartość A280 przez liczbę moli obliczoną w kroku 1.4.
UWAGA: Współczynnik ekstynkcji Fab koziej IgG przy 280 nm wynosi 64 600 M-1.
- Aby upewnić się, że śladowe ilości buforu zawierającego aminy zostaną usunięte, należy odsolić białko na kolumnie utworzonej w krokach 1.1–1.3 i zebrać frakcje białkowe do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (~500 μl na frakcję).
- Zamknij zawór zatrzymujący obrót podłączony do górnej części kolumny i zdejmij górną część kolumny. Jeśli nie jest jeszcze otwarty, otwórz zawór zatrzymujący obrót w dolnej części kolumny i poczekaj, aż "głowica" PBS uderzy w górną część koralików.
- Powoli dodawaj interesujące Cię białko do górnej części kulek za pomocą szklanej pipety Pasteura, uważając, aby zminimalizować zakłócenia na górze kulek.
- Gdy "główka" roztworu białkowego dotrze do górnej części kulek, delikatnie dodaj 1 ml PBS za pomocą pipety Pasteura. Powtórz trzy razy. Dodaj PBS, aby utworzyć wysokość podnoszenia 4–5 cm i powtórz krok 1.3, aby umyć kolumnę.
UWAGA: Ten krok można pominąć, jeśli jest pewne, że nie ma buforu zawierającego aminy.
- Określ frakcje zawierające białko, mierząc wartości A280 i połącz frakcje, które dają około 90% odzysku białka.
UWAGA: To zwykle rozcieńcza białko 1,5-2-krotnie. Określ stężenie białka po łączeniu. Na tym etapie należy zagęścić białko, jeśli to konieczne, za pomocą koncentratora wirowego.
- Dodać do białka 2,5-molowy odpowiednik heterobifunkcyjnego środka sieciującego.
- Najpierw odważyć około 5 mg 3-(2-pirydyloditio)propionianu sukcynimidylu (SPDP, MW = 314 g/mol) do probówki mikrowirówkowej. Aby określić objętość do rozpuszczenia SPDP, weź pomnóż stężenie białka molowego i250x, aby uzyskać 100x roztwór, który da 2,5 molowy nadmiar w reakcji.
UWAGA: Na przykład, jeśli stężenie białka wynosi 50 μM, potrzebny jest roztwór SPDP o stężeniu 12,5 mM. W przypadku 5 mg SPDP odpowiada to 1,27 ml dimetylosulfotlenku (DMSO).
- Dodaj SPDP do interesującego nas białka w rozcieńczeniu 1:100. Umieścić reakcję na wytrząsarce oscylacyjnej w temperaturze pokojowej (RT) na około 1 godzinę.
- Aby usunąć nadmiar SPDP i chronić endogenne wiązania dwusiarczkowe w białku w kolejnym etapie redukcji, należy zrównoważyć i przepłukać kolumnę utworzoną w krokach 1,1–1,3 w 100 mM octanu sodu (NaOAc) o pH 5,5 lub utworzyć identyczną kolumnę wyłącznie do użycia w tym buforze.
- Po 1 godzinie inkubacji z SPDP odsolić białko na kolumnie zrównoważone w 100 mM NaOAc. Przeprowadzić ten etap w identyczny sposób jak w kroku 1.6, z wyjątkiem użycia 100 mM NaOAc (pH 5,5) jako eluentu. Zbierz ułamki, określ A280 i połącz górne frakcje. Umyj kolumnę w PBS.
- Przygotować roztwór 2,5 M naziemnej telewizji cyfrowej (MW = 154 g/mol) w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O). Dodaj 25 mM DTT do połączonych frakcji białka przez 5-10 minut.
- Zmierz A280 białka i podziel go przez współczynnik ekstynkcji. Określ również A343. Obliczyć współczynnik wiązania na podstawie molowości białka (A280) i łącznika (A343).
UWAGA: Wyłącz automatyczną kalibrację A340 w przypadku korzystania ze spektrofotometru nanokroplowego. Pomiar A343 reprezentuje absorbancję grupy 2-tionowej pirydyny (współczynnik ekstynkcji = 7550 M-1), która jest usuwana z sieciownika SPDP przez naziemną telewizję cyfrową. Stosunek molowy łącznika do białka wynoszący 1,2–1,5 jest na ogół osiągany podczas przeprowadzania reakcji z 2,5-molowym nadmiarem SDPD na szerokim zakresie białek.
- Uruchom ułamki w puli na kolumnie umytej w PBS zgodnie z powyższym opisem. Zbierz frakcje, określ A280 i połącz ułamki górne. Oznaczyć stężenie białka przez A280 po połączeniu frakcji.
- Przygotować DSPE-PEG(2000)-maleimid(1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000)-maleimid. Zostanie on dodany do białka w stosunku molowym 10:1. Przygotuj 100-krotny zapas DSPE-PEG(2000)-Maleimidu, aby osiągnąć pożądane stężenie.
- Na przykład, jeśli stężenie białka wynosi 10 μM po kroku 1.14, przygotuj zapas DSPE-PEG(2000)-Maleimidu w temperaturze 10 mM. Ostrożnie odważyć DSPE-PEG(2000)-Maleimid (MW = 3000 g/mol) i dodać odpowiednią ilość DMSO. Wiele rund delikatnego wirowania i sonikacji może spowodować jego całkowite rozpuszczenie.
- Oznaczyć całkowitą objętość frakcji z kroku 1.14 i ostrożnie przenieść roztwór do małej (10-25 ml) kolby okrągłodennej (RBF). Dodaj odpowiednią ilość 100x DSPE-PEG(2000)-Maleimidu do białka, aby uzyskać 1x, 10-krotny nadmiar molowy, końcowe stężenie. Delikatnie zamieszaj roztwór, aby upewnić się, że DMSO jest w pełni rozproszone.
- Przeprowadzić reakcję przez noc pod azotem w szczelnym RBF. Użyj gumowej przegrody i umieść ją w dygestorium.
- Usuń atmosferę, nakłuwając przegrodę igłą 20 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 3 ml na końcu rurki podłączonej do próżni i włącz próżnię na 3–5 sekund.
- Zastąp atmosferę azotem. Napełnij balon dołączony do strzykawki o pojemności 3 ml przeciętej na pół azotem i podłącz igłę 20 G. Przebić przegrodę, aby wypełnić atmosferę wewnątrz kolby okrągłodennej azotem. Powtórz usuwanie atmosfery i ponowne zastąpienie azotem i pozostaw przymocowany balon z azotem na noc.
- Przygotować oddzielną kolumnę perełkową z usieciowanego żelu dekstranowego o zakresie frakcjonowania 4 000–150 000 Da w szklanej kolumnie chromatograficznej o wymiarach 1,0 cm x 50 cm (zgodnie z krokami 1.1-1.3).
- Następnego dnia usunąć białko z kolby okrągłodennej przygotowanej w kroku 1.17 i przelać (zgodnie z metodą zastosowaną w kroku 1.6) na kolumnę z kulkami w żelu dekstranowym usieciowanym (od kroku 1.18).
UWAGA: Całkowita ilość do załadowania do kolumny nie powinna przekraczać 2 ml. Jeśli zastosowano większą reakcję, podziel na dwie części i uruchom na oddzielnych kolumnach lub uruchom na kolumnie o większej średnicy.
- Zbierz frakcje, określ A280, frakcje puli i określ stężenie białka. Obecność lipidu nie będzie miała wpływu na pomiary.
- Końcowe frakcje białka związanego z lipidami należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.
2. Przygotowanie liposomów
- Odważyć lipidy: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000, MW = 2805,5 g/mol; Cholesterol (3b-hydroksy-5-cholesten, 5-cholesten-3b-ol), MW = 386,7 g/mol; i DSPC (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina), MW = 790,1 g/mol. Stworzyć 5 mg / ml roztwór DSPC, 4 mg / ml roztwór cholesterolu i 2 mg / ml roztwór DSPE-PEG (2000) w chloroformie.
- Upewnij się, że stosunek molowy lipidów w liposomach wynosi: 57% DSPC, 38% cholesterolu i 5% DSPE-PEG (2000), jak przedstawiono w tabeli 1.
UWAGA: Ważne jest, aby kontrolować ilość antygenu na liposomie, która zwykle waha się od 0,01–0,1%. W Tabeli 1 użyto 0,1% koziego anty-mysiego fragmentu IgM Fab połączonego z pegylowanym lipidem. Bardzo ważne jest, aby wziąć pod uwagę 10-krotny nadmiar molowy DSPE-PEG(2000)-maleimidu, który został dodany do białka w kroku 1.15, aby upewnić się, że całkowita ilość pegylowanego lipidu nie przekracza 5%.
- Weź pod uwagę końcowe ilości lipidów (μmol) podczas tworzenia lipidów do wytłaczania. W tabeli 1 przedstawiono przykład obliczania molowych stężeń lipidów w celu wytworzenia liposomów przy całkowitym stężeniu lipidów 1,25 μM.
- Po obliczeniu prawidłowej ilości każdego lipidu, który ma zostać dodany, połącz wszystko w probówce ze szkła borokrzemianowego o pojemności 12 ml.
- Ostrożnie zdmuchnij chloroform.
- Za pomocą rurki i strzykawki z igłą o pojemności 3 ml, przygotowanych w kroku 1.17.1, ostrożnie zdmuchnąć chloroform z probówki z azotem. Delikatnie wydmuchaj strumień azotu na roztwór, jednocześnie obracając rurkę drugą ręką. Uważaj, aby zminimalizować rozpryskiwanie lub powodowanie spływania cieczy po boku rurki, ponieważ w następnym kroku może być trudniej wprowadzić ją do roztworu.
- Dodaj 100 μl DMSO do każdej probówki i liofilizuj ten roztwór przez noc. Przykryj górną część probówki niestatyczną chusteczką laboratoryjną, zabezpiecz ją gumką recepturką i zamroź w temperaturze -80 °C.
3. Ekstruzja liposomów
- Dodać 1 ml PBS zawierającego białko związane z lipidami do 12 ml probówki zawierającej lipidy. Sonikować roztwór przez około 30 sekund do 1 minuty w łaźni wodnej sonikującej. Odpoczywaj przez 5 minut lub dłużej między każdą rundą i powtórz 3-4 razy.
- Przygotuj ekstruder zgodnie z zaleceniami producenta.
- Dodaj wsporniki filtra do wewnętrznego wspornika membrany i umieść kilka kropli (po 10 μl każda) PBS na folii parafinowej. Za pomocą pęsety chwyć krawędź wspornika filtra i zanurz go w kropli o pojemności 10 μl.
- Umieść filtr wewnątrz O-ringu. Zrób to dla obu stron. Za pomocą pęsety chwyć filtr 0,8 μm na krawędzi, zanurz kroplę o pojemności 10 μl i pokryj zewnętrzną stronę O-ringu PBS. Delikatnie umieść filtr 0.8 μm na O-ringu, aby filtr nie wystawał poza wewnętrzny wspornik membrany.
- Umieść blok grzewczy ekstrudera na płycie grzejnej, aby wstępnie podgrzać ekstruder. Ustaw płytę grzejną na niskim poziomie i pozwól, aby blok grzewczy ekstrudera osiągnął żądaną temperaturę. Aby uniknąć potencjalnych problemów z agregacją białek, nie podgrzewaj bloku powyżej 37 °C.
- Załaduj sonifikowaną próbkę do jednej ze strzykawek wytłaczających umieszczonych w wytłaczarce. Umieść strzykawkę ekstrudera na drugim końcu ekstrudera. Upewnić się, że tłok pustej strzykawki jest ustawiony na zero. Pusta strzykawka wypełni się, gdy lipid zostanie wytłoczony przez membranę poliwęglanową 0,8 μm. Staraj się unikać przepuszczania pęcherzyków tam iz powrotem przez membranę.
- Umieść w pełni zmontowaną wytłaczarkę w bloku grzewczym. Delikatnie wcisnąć tłok napełnionej strzykawki z lipidami do pustej strzykawki. W zależności od stężenia lipidów będzie to trudne do przeforsowania. Powtórz 20 razy.
- Wyjmij w pełni zmontowaną wytłaczarkę z bloku grzewczego. Powoli wyjmij napełnioną strzykawkę z ekstrudera, pamiętaj, aby zebrać wszelkie lipidy, które mogą wyciekać podczas wyjmowania. Umieść liposomy w czystej fiolce. Powtórz kroki 3.4–3.6, używając membran poliwęglanowych 0,2 μm i 0,1 μm.
- Stwórz usieciowaną kolumnę z kulkami agarozowymi o wymiarach 0,7 x 50 cm2 o zakresie separacji 0,7-10 megadaltonów (MDa) zrównoważonych w PBS. Dodaj liposomy i uruchom jak w kroku 1.6. Frakcje zawierające liposomy będą miały zmniejszoną przepuszczalność światła w zakresie 250–400 nm.
- Przechowuj liposomy w temperaturze 4 °C i nie zamrażaj.
4. Strumień wapnia do monitorowania aktywacji limfocytów B przez liposomy antygenowe
- Eutanazja myszy przez przedawkowanie dwutlenku węgla (CO2 ) lub izofluranu, zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi obowiązującymi w instytucjach. Potwierdź eutanazję myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Sterylizuj narzędzia chirurgiczne i tuszę myszy przy użyciu 70% etanolu. Użyj zakrzywionych kleszczyków do tęczówki o długości 10 cm i końcówce 0,8 mm, aby oddzielić skórę pokrywającą klatkę piersiową od klatki piersiowej. Użyj prostych nożyczek preparacyjnych o długości 10 cm, aby wykonać dystalne nacięcie z obustronnym nacięciem.
- Użyj zakrzywionych kleszczyków tęczówkowych i nożyczek preparacyjnych, aby usunąć śledzionę z jamy brzusznej. Usuń tkankę tłuszczową otaczającą śledzionę, a następnie umieść ją w stożkowej probówce polistyrenowej o pojemności 15 ml RPMI1640 wypełnionej pożywką zawierającą 1% płodową surowicę cielęcą (FCS) i penicylinę-streptomycynę.
- Przenieść śledzionę i pożywkę przez sitko o wielkości 40 μm zamontowane na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Używając gumowej końcówki tłoka strzykawki o pojemności 3 ml, delikatnie zmiażdżyć śledzionę. Umyj sitko komórkowe 40 μm pożywką. Powtarzaj ten proces, aż w sitku do komórek 40 μm pozostanie tylko tkanka tłuszczowa. Przepłucz sito 3-5 ml pożywki, aby zwiększyć regenerację komórek.
- Odwirować homogenat komórek przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i dodać 10 ml 1x buforu do lizy RBC do osadu. Pipetować w górę i w dół, pozostawić na 2–3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić splenocyty zubożone w krwinki czerwone w 10 ml pożywki. Określ całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub innego urządzenia do liczenia komórek. Osadzać komórki przez odwirowanie, jak opisano powyżej.
UWAGA: Idealne stężenie końcowe niezbędne do obciążenia splenocytów Indo-1 wynosi 10–20 x 106 komórek/ml, ale można zastosować niższe stężenie komórek.
- Ponownie zawiesić splenocyty w 15 x 106 komórek/ml w buforze ładującym strumień wapnia (Roswell Park Memorial Institute, RPMI1640 pożywka zawierająca 1% FCS, 10mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES), 1mM chlorek magnezu (MgCl2), 1mM glikol etylenowy-bis(β-aminoetylowy eter)-N, N,N', N'-kwas n'-tetraoctowy (EGTA) i 5% penicyliny-streptomycyny). Dodać 1,5 μM Indo-1 z 1 mM roztworu podstawowego DMSO i kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu wymieszania. Chronić przed światłem i inkubować komórki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Po 30-minutowej inkubacji dodać 5-krotnie większą ilość buforu ładującego topnik wapnia. Wirować przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
- Do bramkowania na komórkach B wybarwić komórki 1:200 anty-mysim CD5-PE i anty-mysim 1:200 B220-PE/Cy7 w 0,5 ml buforu ładującego w temperaturze 4 °C przez 20 minut, chroniąc przed światłem.
- Przemyć splenocyty w buforze ładującym strumień wapnia i odwirować przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki przy 10–20 x 106 komórek/ml w buforze do pracy strumienia wapnia (zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) zawierający 1% FCS, 1 mM MgCl2 i 1 mM chlorku wapnia (CaCl2)). Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem do czasu, gdy będzie gotowy do pracy na cytometrze przepływowym.
- Skonfiguruj cytometrię przepływową z kontrolą niebarwionego i pojedynczego barwienia w celu kompensacji.
- Uruchom poplamione komórki, aby odpowiednio ustawić bramki (patrz Rysunek 1A). Ustaw wykres Indo-1 (fioletowy) kontra Indo-1 (niebieski), dostosuj napięcia w kanałach Indo-1, aby umieścić barwienie komórek pod kątem 45–60°, aby zmaksymalizować stosunek sygnału: szum Indo-1 fioletowy: niebieska zmiana proporcji po stymulacji komórek B.
UWAGA: Upewnij się, że napięcia nie są zbyt wysokie, tak aby znaczny procent ogniw (>5%) znajdował się na górze działki.
- Utwórz bramkę ukośną, która otacza lewą górną część (fioletową + niebieską-) wykresu, tak aby bez stymulacji <10% komórek znajdowało się w bramce, która powinna wzrosnąć do >75% po stymulacji.
- Dodać 0,5 ml komórek do zakorkowanej probówki z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml (probówka do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)) i ogrzewać komórki do 37 °C przez 3–5 minut w łaźni wodnej. Umieść rurkę FACS w komorze z płaszczem wodnym o temperaturze 37 °C, która jest podłączona do recyrkulacyjnej łaźni wodnej.
- Uruchom rurkę w płaszczu wodnym na cytometrze przepływowym i rozpocznij akwizycję, bez zapisywania danych, przy około 5 000–10 000 zdarzeń / s. Gdy komórki się ustabilizują (15–30 s), zainicjuj akwizycję danych i zbieraj dane przez co najmniej 10 sekund, aby ustalić tło.
- Przy znaku 10 smarków szybko wyjmij rurkę z cytometru przepływowego, dodaj stymulację (5-50 μM antygenowych liposomów w 2-20 μl), wir impulsowy i zwróć probówkę FACS do cytometru przepływowego. Utrzymuj akwizycję i przechowywanie danych przez ten czas i zbieraj dane przez 3–5 minut.
- Analizuj dane w odpowiednim oprogramowaniu analitycznym w ramach funkcji kinetycznych.
Tabela 1: Obliczenia do stworzenia liposomu o całkowitym stężeniu lipidów 1,25 μM.Przykład tabeli obliczeniowej dla kozich liposomów fragmentów anty-mysich IgM F(ab).
szt.
SZT.
szt.
szt.
szt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
TGL
TGE
| Mw | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| Oprogramowanie DSPC | cholesterol | PEG-DSPE | nadmiar PEG-DSPE | aIgM-PEG-DSPE | łączny |
| Stosunek molowy | 57 | 38 Rozdział 38 | 3,9 | 1 | 0,1 | Godzina 100,00 |
| Masa (mg) | 0,56 | 0,18 | 0,14 | 0,04 | 0,06 | 0,98 |
| mmol powiedział: | 0,71 | 0,47 | 0,05 | 0,01 | 0,00 | Wydanie orzeczenia 1,25 |
| Ml | 112,50 | 45,93 | 70,64 | 0,00 | 525,97 | 755.03 |
| | | Stężenie (mg/ml) | | | |
| | Oprogramowanie DSPC | 5 | | | |
| | cholesterol | 4 | | | |
| | PEG-DSPE | cyfra arabska | | | |
| | aIgM-PEG-DSPE | 0,114 | | | |
