Zagęszczenie białka filtratu kultur bakteryjnych za pomocą urządzenia do ultrafiltracji

Streszczenie

Źródło: Ryan, J. M., et al. Mycobacterium tuberculosis Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez chromatografię wykluczania wielkości. J. Vis. Exp. (183) (2022)

Ten film demonstruje izolację i koncentrację białek filtratu kultur bakteryjnych, w tym pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii, przy użyciu ultrafiltracji. Skoncentrowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe służą jako markery diagnostyczne do wykrywania choroby.

Protokół

1. Przygotowanie surowego koncentratu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

UWAGA: Szczegółowe procedury dotyczące uprawy Mtb i przygotowania białka filtratu kulturowego (CFP). Zaleca się, aby pożywki do hodowli bakteryjnych były wolne od suplementów wzrostu zawierających EV lub składników białkowych, takich jak albumina oleinowa i katalaza dekstrozy (OADC) oraz detergentów, takich jak Tween. Zaleca się również, aby jakość kultury bakteryjnej i zebrany CFP były badane przesiewowo, aby zapewnić ograniczoną śmierć i lizę komórek.

1. Przygotować filtr odśrodkowy o masie cząsteczkowej 100 kDa (MWCO) (patrz tabela materiałów), dodając pełną objętość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS). Wirować przez 5 minut w temperaturze 2.800 x g w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Wprzypadku korzystania z filtra bez martwej objętości należy zadbać o to, aby objętość próbki nie zmniejszyła się poniżej poziomu filtra, co spowodowałoby całkowite wysuszenie filtra podczas wirowania.
2. Odrzucić przepływowy i pozostały PBS przed napełnieniem komory na próbkę Mtb CFP do maksymalnej pojemności. Odwirować przy 2 800 x g w temperaturze 4 °C do momentu, gdy objętość zmniejszy się do minimalnej objętości urządzenia do ultrafiltracji. Powtórz w razie potrzeby, dodając więcej CFP do urządzenia, aż cała próbka zostanie wystarczająco zredukowana.
   nuta: W razie potrzeby należy zachować część materiału przepływowego o natężeniu 100 kDa (100F) do dalszej kwalifikacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Dodać 1x PBS do jednostki filtrującej zawierającej koncentrat do całkowitej pojemności urządzenia. Zmniejsz głośność zgodnie z opisem w 1.2. Powtórz ten krok pięć razy, aby zapewnić całkowite umycie i wymianę bufora.
4. Odzyskać skoncentrowany retentat CFP o stężeniu 100 kDa (100R) zgodnie ze specyfikacją urządzenia do ultrafiltracji (patrz tabela materiałów). Po odzyskaniu 100R umyj filtr minimalną objętością 1x PBS co najmniej trzy razy i połącz płukanie z 100R, aby zmaksymalizować odzysk.
5. Określić ilościowo materiał 100R za pomocą testu bicynkonicznego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Aby wykonać test, użyj kilku rozcieńczeń próbek 1:2, 1:5 i 1:10 w PBS. Zbadać próbkę w trzech egzemplarzach.
   nuta: W razie potrzeby zachowaj część materiału 100R do dalszej kwalifikacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Automatyczny kolektor frakcji	Nauka IZON	AFC-V1-USD
Centricon Plus - 70 Filtr odśrodkowy, odcięcie 100 kDa	Millipore Sigma	UFC710008	Urządzenie do ultrafiltracji użyte w kroku 1.1
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1X bez wapnia i magnezu	Corning	21-040-CV
Membrana nitrocelulozowa, rolka, 0,2 μm	Przedsiębiorstwo BioRad	1620112