1. Przygotowanie surowego koncentratu Mtb EV
UWAGA: Szczegółowe procedury dotyczące uprawy Mtb i przygotowania białka filtratu kulturowego (CFP) znajdują się w Bibliografii. Zaleca się, aby pożywki do hodowli bakteryjnych były wolne od suplementów wzrostu zawierających EV lub składników białkowych, takich jak albumina oleinowa i katalaza dekstrozy (OADC) oraz detergentów, takich jak Tween. Zaleca się również, aby jakość kultury bakteryjnej i zebrany CFP były badane przesiewowo, aby zapewnić ograniczoną śmierć i lizę komórek.
- Przygotować filtr odśrodkowy o masie cząsteczkowej 100 kDa (MWCO) (patrz tabela materiałów), dodając pełną objętość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS). Wirować przez 5 minut w temperaturze 2.800 x g w temperaturze 4 °C.
nuta: W przypadku korzystania z filtra bez martwej objętości należy zadbać o to, aby objętość próbki nie zmniejszyła się poniżej poziomu filtra, co spowodowałoby całkowite wysuszenie filtra podczas wirowania.
- Odrzucić przepływowy i pozostały PBS przed napełnieniem komory na próbkę Mtb CFP do maksymalnej pojemności. Odwirować przy 2 800 x g w temperaturze 4 °C do momentu, gdy objętość zmniejszy się do minimalnej objętości urządzenia do ultrafiltracji. Powtórz w razie potrzeby, dodając więcej CFP do urządzenia, aż cała próbka zostanie wystarczająco zredukowana.
nuta: W razie potrzeby należy zachować część materiału przepływowego o natężeniu 100 kDa (100F) do dalszej kwalifikacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Dodać 1x PBS do jednostki filtrującej zawierającej koncentrat do całkowitej pojemności urządzenia. Zmniejsz głośność zgodnie z opisem w 1.2. Powtórz ten krok pięć razy, aby zapewnić całkowite umycie i wymianę bufora.
- Odzyskać skoncentrowany retentat CFP o stężeniu 100 kDa (100R) zgodnie ze specyfikacją urządzenia do ultrafiltracji (patrz tabela materiałów). Po odzyskaniu 100R umyj filtr minimalną objętością 1x PBS co najmniej trzy razy i połącz płukanie z 100R, aby zmaksymalizować odzysk.
- Określić ilościowo materiał 100R za pomocą testu bicynkonicznego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Aby wykonać test, użyj kilku rozcieńczeń próbek 1:2, 1:5 i 1:10 w PBS. Zbadać próbkę w trzech egzemplarzach.
nuta: W razie potrzeby zachowaj część materiału 100R do dalszej kwalifikacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Chromatografia wykluczania wielkości do wzbogacania Mtb EV z CFP
UWAGA: Poniższa procedura jest specyficzna dla użycia 3 mg 100R Mtb CFP z kolumną SEC i automatycznym kolektorem frakcji (AFC, patrz Tabela Materiałów). Można go dostosować do innych stężeń początkowych i typów kolumn, postępując zgodnie ze specyfikacjami producenta. Dodatkowo użytkownikom zaleca się przeczytanie i zrozumienie instrukcji obsługi automatycznego kolektora frakcji.
- Pozwól, aby kolumna SEC zrównoważyła się do temperatury pokojowej.
- Włącz AFC za pomocą wyłącznika zasilania z tyłu jednostki wieżowej i w razie potrzeby dostosuj ustawienia ogniwa obciążnikowego, naciskając przycisk SETUP na ekranie dotykowym menu głównego. Czujnik wagowy należy kalibrować tylko przy pierwszym użyciu, po każdej aktualizacji oprogramowania i w przypadku zauważenia niespójności w objętościach zbierania frakcji.
- Na ekranie SETUP (Konfiguracja) wyrównaj karuzelę, wybierając opcję KARUZELA > KALIBRUJ. Włóż karuzelę z 13 małymi otworami skierowanymi do góry do wieży AFC i wyreguluj karuzelę tak, aby dysza płynu znajdowała się bezpośrednio nad pozycją spłukiwania, naciskając przyciski - i/lub +.
- Usuń zaślepki z zrównoważonej kolumny SEC. Wsuń kolumnę SEC do odpowiedniego uchwytu kolumny i ostrożnie zainstaluj ją na wieży AFC. Upewnij się, że znacznik identyfikacji radiowej (RFID) na kolumnie jest skierowany w stronę AFC i sprawdź, czy połączenie między kolumną a zaworem jest bezpieczne. Umieść rurkę odprowadzającą odpady w pojemniku zbiorczym.
- Na ekranie SETUP wybierz Harmonogram odbioru i ustaw liczbę na 13, a rozmiar na 0.5 ml, naciskając przyciski - i/lub +. Pozostaw ustawienie "Objętość bufora" jako domyślne 2,7 ml, a następnie zamknij okno "Harmonogram odbioru", naciskając X.
- Wybierz ROZPOCZNIJ KOLEKCJĘ na ekranie głównym i potwierdź parametry zbierania, wybierając TAK. Załaduj 13 oznaczonych probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml z otwartymi pokrywkami i skierowanymi w stronę środka karuzeli.
- Przesuń AFC, wybierając OK, a następnie zamontuj zbiornik kolumny i ponownie przejdź, naciskając OK. Wybierz opcję opróżnienia kolumny, naciskając przycisk TAK, a następnie dodaj jeden wolumin kolumny PBS filtrowanego przez 0,2 μm, aby usunąć bufor magazynu. Po zakończeniu spłukiwania przesuń AFC, naciskając OK.
- Umieść pokrywę karuzeli na AFC i naciśnij OK. Przygotować jedną objętość jednej kolumny z filtrowanym PBS 0,2 μm. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar buforu z kolumny.
- Przynieś 3 mg próbki 100R, jak określono ilościowo w kroku 1.5, do 500 μL z 1x PBS. Dodać próbkę 3 mg na górze kolumny. Przesunąć AFC i pozwolić, aby próbka spłynęła do fryty. Gdy próbka całkowicie wprowadzi się do kolumny, dodać PBS przygotowany w kroku 2.6 do zbiornika.
- Monitoruj przebieg AFC, gdy zbiera on najpierw wolumin pustek, a następnie określone frakcje. Po zakończeniu biegu i powrocie karuzeli do pozycji odpadu zdejmij pokrywę i wyjmij rurki frakcji z karuzeli. Frakcje należy przechowywać w temperaturze 4 °C przed oznaczaniem ilościowym (etap 3) i kwalifikacją (etap 4).
- Jeśli kolumna ma być ponownie użyta, wybierz opcję czyszczenia kolumny, naciskając przycisk TAK; w przeciwnym razie naciśnij przycisk NIE. Postępuj zgodnie z instrukcjami na AFC.
UWAGA: Po umyciu kolumny i przepuszczeniu bufora magazynowego można ją wyjąć, zakryć i przechowywać w temperaturze 4 °C.