Technika ilościowego określania infekcji grzybiczej u larw danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Thrikawala, S., et al. Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje metodę ilościowego określania infekcji grzybiczej u larw danio pręgowanego. Zarodniki grzybów są mikrowstrzykiwane do larwalnej komory tyłomózgowia, a larwy są inkubowane, aby umożliwić rozwój infekcji. Zakażone larwy są zbierane w określonych odstępach czasu, a postęp infekcji ocenia się poprzez wyliczenie jednostek tworzących kolonie.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie zarodników Aspergillus do iniekcji

1. Z zawiesiny zarodników Aspergillus oblicz objętość potrzebną do uzyskania 1 x 10⁶ zarodników. Objętość powinna wynosić 20–100 μl; jeśli nie, należy wykonać 10-krotne rozcieńczenie w 0,01% (v/v) sterylnym Tween-20 (Tween-water; Tabela materiałów). Na przykład, jeśli obliczona objętość wynosi 5 μl, należy wykonać 10-krotne rozcieńczenie i użyć 50 μl rozcieńczonego roztworu.
   nuta: Można przygotować dwie płytki/szczepy w celu zebrania większej liczby zarodników lub jako zapas w przypadku zanieczyszczenia.
2. Rozprowadź 1 x 10⁶ zarodników Aspergillus na jednej płytce z minimalną pożywką glukozy (GMM) (tabela materiałów) za pomocą sterylnego jednorazowego rozsiewacza w kształcie litery L w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Unikaj rozprowadzania na marginesie talerza. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3–4 dni, z płytką skierowaną do góry nogami.
3. W dniu zbiórki przynieś sterylną miracloth i stożkowe probówki o pojemności 50 ml (po dwie na szczep), świeże butelki sterylnej wody Tween-water (po jednej na szczep) oraz sterylne jednorazowe rozsiewacze w kształcie litery L do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
   nuta: Miracloth można pokroić na ~8 cali x 6 na kawałki, zawinąć w folię i sterylizować w autoklawie w celu sterylizacji.
4. Umieść jeden kawałek miracloth w każdej oznaczonej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i ponownie zakryj. Wyjmij pozostałą paczkę miracloth z maski.
5. Wnieś płytki do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Otwórz jeden talerz, a następnie wlej na wierzch wodę Tween, aby pokryć około trzech czwartych talerza.
6. Za pomocą jednorazowego rozsiewacza w kształcie litery L delikatnie zeskrob powierzchnię kultury grzybów ruchem w przód iw tył, jednocześnie obracając płytkę drugą ręką. Zeskrobuj, aż prawie wszystkie zarodniki zhomogenizują się z wodą Tween .
   nuta: Ze względu na wysoką hydrofobowość zarodniki mogą tworzyć "zaciągnięcia" po dodaniu wody Tween lub podczas skrobania. Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia pobliskich rurek lub płytek. Zaleca się zmianę rękawiczek i wytarcie powierzchni 70% etanolem między ekstrakcją różnych szczepów.
7. Weź jedną stożkową probówkę o pojemności 50 ml i usuń kawałek miracloth. Złóż go na pół i przełóż do filtra umieszczonego w górnej części stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
8. Wlej homogenat grzybów z płytki na miracloth do probówki.
   nuta: Jeśli przygotowane są dwie płytki jednego szczepu, zeskrob obie płytki i wlej je do tej samej stożkowej rurki.
9. Wlej wodę z Tcheen, aby całkowita objętość w stożkowej rurce wynosiła 50 ml.
10. Wirować z prędkością 900 x g przez 10 minut. Upewnij się, że w wirówce używasz nasadek zapobiegających aerozolowaniu.
11. Wlej supernatant do ~10% roztworu wybielacza w celu odkażenia. Wlej 50 ml sterylnego 1x PBS do stożkowej probówki, a następnie zwiruj lub wstrząśnij, aby ponownie zawiesić granulkę.
12. Wirować ponownie przy 900 x g przez 10 minut. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml sterylnego 1x PBS. Przefiltruj przez świeży kawałek miracloth do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
13. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia (10x, 100x, 1000x) homogenatu grzybów w probówkach wirówkowych o pojemności 1,7 ml (np. dla 10-krotnego roztworu zmieszać 100 μl homogenatu grzybowego z 900 μl wody tween-water).
14. Wybierz pierwsze rozcieńczenie, w którym zarodniki nie są widoczne, gdy jest ono odprowadzane do wody Tween-water i użyj tego rozcieńczenia, aby policzyć liczbę zarodników za pomocą hemocytometru.
15. Obliczyć stężenie przetrwalników w przygotowanym homogenacie grzybów (zawiesinie wodnej) według następującego wzoru:
    Stężenie (zarodniki/ml) = liczba zarodników w środku 25 pudełek x współczynnik rozcieńczenia x 10⁴
16. Przygotuj 1 ml zapasu 1,5 x 10⁸ zarodników/ml w sterylnym 1x PBS w probówce mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Ten preparat przetrwalnikowy może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez ~ 4 tygodnie.
17. Przed użyciem w iniekcjach należy zmieszać 20 μl preparatu przetrwalnikowego z 10 μl 1% sterylnej czerwieni fenolowej w probówce wirówkowej o pojemności 1,7 ml, aby uzyskać końcowe stężenie zarodników 1 x 10⁸ zarodników/ml. Dokładnie przetrząsnąć przed wstrzyknięciem.
    UWAGA: 1% roztwór czerwieni fenolowej powinien być sterylizowany filtrem i przechowywany w podwielokrotnościach.
18. W przypadku próbnego wstrzyknięcia należy zmieszać 20 μl 1x PBS z 10 μl 1% sterylnej czerwieni fenolowej.

2. Przygotowanie płytek agarowych do wstrzykiwań

1. Przygotuj 2% agarozy w podłożu E3 i rozpuść w kuchence mikrofalowej.
2. Wlać do szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm (~25 ml na płytkę), zamieszać, aby równomiernie pokryć płytkę i ostudzić.
3. Owinąć płytkę folią parafinową i przechowywać w pozycji odwróconej w temperaturze 4 °C.
4. Przed wstrzyknięciem należy doprowadzić płytkę do temperatury pokojowej (RT).
5. Wlej ~1 ml wysterylizowanej przez filtr 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na płytkę, przechyl płytkę, aby rozprowadzić i przykryj całe dno, a następnie spłucz E3.
   UWAGA: 2% roztwór BSA może być sterylizowany przez filtr i przechowywany w postaci 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. 2% wstępna obróbka BSA zapobiega przywieraniu larw do powierzchni agarozy.
6. Wylać E3 z buforowaną trickainą na płytkę i pozostawić do momentu wstrzyknięcia.

3. Mikroiniekcja do komory tylnej larwy danio pręgowanego

1. Ręcznie dechorionować larwy za pomocą kleszczy po 2 dniach od zapłodnienia (dpf) na szalce Petriego.
   nuta: Dekorionacja może być wykonywana w dowolnym momencie od 1,5 dpf do momentu wstrzyknięcia.
2. Usunąć jak najwięcej E3 z szalki Petriego i dodać buforowaną 300 μg/ml trikainy w E3 w celu znieczulenia larw.
   nuta: Można przygotować i przechowywać roztwór podstawowy trikainy o stężeniu 4 mg/ml w E3 w temperaturze 4 °C. Roztwór roboczy można przygotować przez rozcieńczenie 4 ml roztworu podstawowego do 50 ml z E3.
3. Użyj zestawu do mikroiniekcji dostarczonego z wtryskiwaczem ciśnieniowym, jednostką przeciwciśnieniową, przełącznikiem nożnym, uchwytem na mikropipety, mikromanipulatorem oraz stojakiem magnetycznym i płytką, a wszystko to podłączone do źródła sprężonego powietrza (tabela materiałów).
4. Otwórz zawór sprężonego powietrza i włącz mikrowtryskiwacz. Ustaw ciśnienie na ~25 PSI, czas trwania impulsu na 60 ms, a jednostkę ciśnienia zwrotnego na 1 PSI.
5. Do igły do mikroiniekcji za pomocą końcówki pipety z mikroładowarką (tabela materiałów) należy naładować około 3–5 μl przygotowanej zawiesiny PBS lub zawiesiny zarodników z czerwienią fenolową. Zamontuj igłę na mikromanipulatorze.
   nuta: Igły do mikroiniekcji można przygotować zgodnie z wcześniejszym opisem. Mikroskop stereoskopowy używany do mikroiniekcji powinien być wyposażony w siatkę okularową do kalibracji igły do mikroiniekcji. Siatkę należy skalibrować za pomocą mikrometru stopniowego i określić długość skali siatki celowniczej (μm). Średnica kropli zawiesiny zarodników, która wyrzuca się z igły, jest mierzona w zależności od liczby haszyszów (siatki), które nakładają się na kroplę.
6. Ustaw mikromanipulator tak, aby koniec igły był widoczny przy najmniejszym powiększeniu pod mikroskopem stereoskopowym. Powiększ do 4-krotnego powiększenia, utrzymując igłę w zasięgu wzroku.
7. Za pomocą ostrych kleszczy przytnij koniec igły. Nacisnąć pedał wtrysku, aby uwidocznić wielkość wydostającej się kropli. Kontynuuj przycinanie, aż ~ 3 nL zawiesiny zarodników zostanie wstrzyknięte (tutaj jest to pięć haszyszów).
8. Odsunąć mikromanipulator i igłę na bok, aby uniknąć przypadkowego uderzenia w igłę, gdy larwy są ułożone na płytce iniekcyjnej.
9. Wylać E3-Trikainę z płytki iniekcyjnej, a następnie przenieść ~24 znieczulone larwy na płytkę iniekcyjną z jak najmniejszą ilością E3 za pomocą pipety do przenoszenia.
10. Za pomocą małego narzędzia do manipulowania larwami danio pręgowanego (tj. narzędzia do pętli do włosów lub narzędzia do rzęs), ułóż larwy zgodnie z kierunkiem, w którym są zwrócone. W szczególności umieść wszystkie zwrócone w prawo w jednym rzędzie, a wszystkie skierowane w lewo w rzędzie poniżej.
    nuta: Ten układ jest trudny, jeśli na talerzu jest zbyt dużo płynu, ponieważ larwy będą "unosić się" z miejsca. Jednak zbyt mała ilość płynu jest również problematyczna, jeśli zastrzyki trwają długo, ponieważ larwy mogą wyschnąć lub znieczulenie zniknie. Dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na ilość płynu na płytce podczas całego procesu mikroiniekcji.
11. Dostosuj zoom mikroskopu do najmniejszego powiększenia. Sprowadź mikromanipulator z powrotem i ustaw go tak, aby igła znajdowała się blisko larw, pod kątem ~30°–60°, w środku pola widzenia.
12. Powiększ do największego powiększenia i użyj pokręteł precyzyjnej regulacji, aby jeszcze bardziej dostosować położenie igły. Sprawdź, czy ~30–70 zarodników wydostaje się z igły, wstrzykując zawiesinę zarodników do płynu na płytce obok larw. W razie potrzeby dostosuj czas i ciśnienie w konfiguracji wtrysku.
    nuta: Test ten należy powtarzać co pięć do sześciu larw, ponieważ liczba zarodników wychodzących z igły może z czasem wzrosnąć lub zmaleć.
13. Zaczynając od rzędu, w którym larwy są skierowane w stronę igły, przesuń płytkę tak, aby igła znajdowała się bezpośrednio nad i znajdowała się w pobliżu pierwszych larw.
14. Przesuwając igłę za pomocą mikromanipulatora, włóż igłę przez tkankę wokół pęcherzyka usznego, aby przebić się do komory tylnomózgowia. W razie potrzeby przesuń płytkę drugą ręką, aby uzyskać właściwą orientację larwy wraz z kątem igły.
15. Wzrokowo sprawdź, czy koniec igły znajduje się pośrodku komory tyłomózgowia, naciśnij pedał nożny, aby wstrzyknąć zarodniki, i delikatnie wycofaj igłę.
    nuta: Czerwony barwnik fenolowy powinien przede wszystkim pozostać w komorze tyłomózgowia. Niewielka ilość może dostać się do śródmózgowia, ale nie powinna dotrzeć do przodomózgowia ani na zewnątrz mózgu. Jeśli tak się stanie, oznacza to, że wstrzykiwana objętość jest zbyt duża, a ciśnienie i czas powinny zostać odpowiednio zmniejszone lub należy skalibrować nową igłę.
16. Przesuwając się w dół płytki, wstrzyknij wszystkie larwy w tym rzędzie. Następnie odwróć płytkę i wstrzyknij wszystkie larwy do drugiego rzędu.
    nuta: Nieudane wstrzyknięcia lub przypadkowo uszkodzone larwy można oznaczyć poprzez 1) kilkukrotne wstrzyknięcie do żółtka w celu utworzenia czerwonego znaku lub 2) wyciągnięcie larwy z rzędu za pomocą igły.
17. Przesuń igłę w górę i ponownie odsuń ją od drogi. Pomniejsz do mniejszego powiększenia mikroskopu. Czerwony barwnik fenolowy powinien być nadal widoczny w tyłomózgowiu każdej larwy.
18. Najpierw odciągnij za pomocą pętli do włosów i pipety w górę, aby pozbyć się larw po nieudanych wstrzyknięciach. Przenieść pozostałe larwy na nową szalkę Petriego, zmywając je z płytki świeżym sterylnym E3 i pipetą do przenoszenia.
19. W razie potrzeby powtórzyć tę czynność dla żądanego końcowego numeru próbki doświadczalnej.
20. Wypłucz larwy co najmniej 2x E3 i zapewnij powrót do zdrowia po znieczuleniu.
21. Aby określić ilościowo przeżywalność bez dalszego leczenia, za pomocą pipety transferowej przenieś larwy do 96-dołkowej płytki (1 larwa na studzienkę) w E3.

4. Ustalanie liczby wstrzykniętych i zdolnych do życia zarodników

1. Natychmiast po wstrzyknięciu, za pomocą pipety transferowej, losowo wybierz około ośmiu wstrzykniętych larw i przenieś je do probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml (jedna larwa na probówkę).
2. Eutanazja larw za pomocą trikainy lub poprzez umieszczenie ich w temperaturze 4 °C na 0,5–2,0 h.
3. Przygotuj 1 ml 1 mg / ml ampicyliny i 0,5 mg / ml roztworów antybiotyków kanamycyny w sterylnym 1x PBS. Pozostały roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć później.
   nuta: Roztwory podstawowe ampicyliny w stężeniu 100 mg/ml i kanamycyny w stężeniu 50 mg/ml mogą być wstępnie przygotowane, wysterylizowane przez filtr i przechowywane w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć je 100x w 1x PBS, aby otrzymać roztwór roboczy.
4. Za pomocą pipety usuń jak najwięcej płynu z probówki wirówkowej, pozostawiając larwę, i dodaj 90 μl 1x PBS z antybiotykami.
   nuta: Antybiotyki są stosowane w celu zapobiegania rozwojowi bakterii na płytkach GMM, które mogą zakłócać liczenie kolonii Aspergillus.
5. Homogenizować larwy w lizerze tkankowym przy 1 800 oscylacjach/min (30 Hz) przez 6 minut. Wirować w dół przy 17 000 x g przez 30 s.
6. Oznaczyć płytki GMM (jedna płytka na homogenizowane larwy). Używając palnika Bunsena, aby stworzyć sterylne środowisko, odpipetuj homogenizowaną zawiesinę z jednej probówki do środka płytki GMM, a następnie rozprowadź za pomocą jednorazowego rozsiewacza w kształcie litery L. Unikaj rozprowadzania homogenatu na krawędzi.
7. Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 37 °C przez 2–3 dni i policzyć liczbę utworzonych kolonii (CFU).
8. Aby zmierzyć liczbę żywych zarodników w okresie infekcji, należy pobrać larwy z 96-dołkowych płytek po 1–7 dniach od wstrzyknięcia (dpi) i przenieść je do probówek wirówkowych. Poddaj eutanazji i homogenizacji larwy w celu rozprzestrzenienia się na płytkach GMM, jak opisano w krokach 4.1–4.5.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze Dumonta #5	Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.	Złącze RS-5045
Siatka celownicza	Świat mikroskopów	RETR10	Do kalibracji igieł, używanych w mikroskopie stereoskopowym
Konfiguracja mikrowtryskiwaczy: Jednostka ciśnienia zwrotnego	Stosowane oprzyrządowanie naukowe	Jednostka BPU
Przełącznik nożny	Stosowane oprzyrządowanie naukowe	Indeks FTSW
Zestaw uchwytów do mikropipet	Stosowane oprzyrządowanie naukowe	M-
Wtryskiwacz ciśnieniowy	Stosowane oprzyrządowanie naukowe	Protokół MPPI-3
Konfiguracja mikromanipulatora: Mikromanipulator	Narashige (Tritech)	Samolot M-152
Podstawka magnetyczna i talerz	Technologia Tritech	MINJ-HBMB
Ściągacz do igieł	Instrument Suttera	Zobacz materiał P-97
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	Zobacz materiał SMZ-745
Tissuelyser II	Qiagen powiedział:	Numer katalogowy: 85300	Aby homogenizować larwy
materiał
Agarozy	rybak	Zobacz materiał BP160-500
Sól sodowa ampicyliny	rybak	AAJ6380706
BSA, frakcja V	Firma VWR	AAJ65855-22
Siarczan kanamycyny	rybak	AAJ1792406
Rozsiewacze L	rybak	tel. 14 665 230
Igły mikrokapilarne (bez filamentu)	Światowe instrumenty precyzyjne (WPI)	TW100-3
Końcówki do pipet do mikroładowarek	Firma VWR	Numer katalogowy: 89009-310	Aby naładować igłę zawiesiną Aspergillus
Tkanina Miracloth	Firma VWR	EM475855-1R	Filtrowanie zawiesiny Aspergillus
N-fenylotiomocznik	rybak	AAL0669009	Aby zapobiec pigmentacji
Czerwień fenolowa, 1% roztwór	rybak	Numer katalogowy: 57254
Trikaina (3-aminobenzoesan etylu, sól kwasu metanosulfonowego)	rybak	AC118000500	Aby znieczulić larwy
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	rybak	Zobacz materiał BP337-500
Media i rozwiązania			Składniki/Receptura
Nośniki E3: 60x E3			17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,9 g CaCl2, 4,9 g MgSO4 · 7H2O, do 1 L z H2O
1x E3			16,7 ml 60x bulion, 430 ul 0,05 M NaOH, do 1 l z H2O (opcjonalnie: + 3 ml 0,01% błękitu metylenowego)
Roztwór podstawowy trikainy			2 g Trikaina, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4,2 ml 60X E3, do 500 ml zH2O, pH do 7,0-7,5 z NaOH
Agar z minimalną ilością glukozy (GMM): agar GMM			10 g glukozy (dekstrozy), 50 ml 20x Sole azotanowe, 1 ml TE, do 1 l z H2O, pH do 6,5 z NaOH, + 16 g Agar, autoklaw
20x Sole azotanowe			120 g NaNO3, 10,4 g KCl, 10,4 g, MgSO4 · 7H2O, 30,4 g, KH2PO4, do 1 L z H2O, autoklaw
Pierwiastki śladowe (TE)			2,20 g ZnSO4 · 7H2O, 1,10 g H3BO3, 0,50 g MnCl2 · 4H2O, 0,16 g FeSO4 · 7H2O, 0,16 g CoCl2 · 6H2O, 0,16 g CuSO4 · 5H2O, 0,11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5,00 g Na2EDTA, do 100 ml zH2O, rozpuścić mieszając przez noc, autoklaw

okularu powiedział: