Technika fotokonwersji do badania dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach owadów

Abstract

Źródło: Weavers, H. et al., Długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach Drosophila.J. Vis. Exp. (2018)

Film demonstruje wykorzystanie fotokonwersji do badania dynamiki komórek zapalnych u poczwarek Drosophila. Zielone hemocyty są przyciągane do uszkodzonego nabłonka, po czym następuje dalsza migracja. Fotokonwersja przesuwa niektóre hemocyty z zielonego na czerwony, ułatwiając śledzenie ich ruchu.

Protocol

Ten protokół składa się z czterech głównych etapów: (1) Przygotowanie stad Drosophila i inscenizacja poczwarek Drosophila, (2) Rozwarstwienie i montaż poczwarki, (3) Ranienie poczwarki, (4) Obrazowanie konfokalne in vivo w czasie poklatkowym.

1. Przygotowanie stad Drosophila i inscenizacja poczwarek

1. Zaopatrzyć się w odpowiednie stada Drosophila (patrz Wprowadzenie i Spis materiałów).
2. Zbieraj młode, zdrowe dorosłe muchy o odpowiednim genotypie.
   1. Wybierz dorosłe muchy, używając podkładek z dwutlenkiem węgla, aby na krótko znieczulić muchy i cienkiego pędzla, aby przenieść muchy o odpowiednim genotypie lub płci do fiolki do pobrania.
   2. Dodać 20 dziewiczych samic i 20 samców do każdej fiolki zawierającej standardowe podłoże pokarmowe dla much (mieszanina mąki kukurydzianej, melasy i agaru, patrz tabela materiałów) uzupełnioną drożdżami.
3. W celu optymalnego wytworzenia poczwarki, dorosłe muchy należy codziennie przesypywać nowe pożywienie w świeżych fiolkach, utrzymując wszystkie fiolki w temperaturze 25 °C.
   nuta: Jeśli system sekwencji aktywującej Gal4-upstream (Gal4-UAS) jest używany do sterowania ekspresją genów specyficzną dla linii, wszystkie kroki należy wykonać w temperaturze 25 °C lub wyższej, ponieważ system Gal4-UAS jest wrażliwy na temperaturę.
4. Na 18 godzin przed planowaną sesją obrazowania należy pobrać z fiolek co najmniej 10 nowo utworzonych białych poczwarek wstępnych (ryc. 1A) (tj. 0 godzin po utworzeniu poczwarki, APF) za pomocą kleszczy lub cienkiego pędzla, aby usunąć poczwarki z wewnętrznej powierzchni fiolki i ostrożnie przenieść poczwarki na bok czystej, pustej plastikowej fiolki.
   nuta: Wędrujące larwy w 3.^stadium wypełzają w górę z pożywki pokarmowej, aby przejść przepoczwarzenie; Nowo powstałe białe poczwarki są łatwe do zidentyfikowania, ponieważ mają przetchlinki przednie i są nieruchome (w przeciwieństwie do larw w 3.^stadium). Naskórek przekształca się w "puparium" (otoczkę poczwarki), która jest początkowo miękka i biała. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić poczwarek, ponieważ może to prowadzić nie tylko do niepożądanej reakcji zapalnej wywołanej urazem, ale także do znacznego opóźnienia rozwoju.
5. Starzeć wybrane poczwarki do odpowiedniego stadium rozwojowego (18 h APF da optymalne wyniki) w fiolce w temperaturze 25 °C.
   nuta: W miarę rozwoju poczwarek poczwarka staje się coraz ciemniejsza i bardziej krucha.
6. Przygotuj inne odczynniki do następnego kroku z wyprzedzeniem. Aby zrobić klej heptanowy, połącz zwiniętą dwustronną taśmę o długości 20 cm z 20 ml heptanu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, uszczelnij folią parafinową i kołysz przez noc w temperaturze pokojowej na stole.

2. Przygotowanie i rozbiór poczwarek Drosophila

1. Przenieś poczwarki Drosophila na kawałek dwustronnej taśmy klejącej zamontowanej na szkiełku podstawowym. Ustaw poczwarki tak, aby strona brzuszna była mocno przyklejona do taśmy, a strona grzbietowa była skierowana do góry (ryc. 1B).
   nuta: Przednia część poczwarki będzie możliwa do zidentyfikowania na podstawie dwóch przetchlinków wystających z przedniego końca koperty poczwarki.
2. Ostrożnie usuń poczwarki z ich ochronnej osłony poczwarki pod mikroskopem preparacyjnym w jasnym polu za pomocą kleszczy i mikronożyczek (ryc. 1B-D).
   1. Początkowo wykonaj nacięcie w najbardziej przedniej części poczwarki za pomocą kleszczy (ryc. 1B). Upewnij się, że poczwarka w tym obszarze jest pusta i pozbawiona tkanki poczwarki, ponieważ poczwarki skurczą się w obrębie koperty we wczesnym rozwoju poczwarki.
   2. Po tym początkowym nacięciu ostrożnie rozerwij lub rozetnij obudowę poczwarki w kierunku od przodu do tyłu za pomocą kleszczy lub mikronożyczek (ryc. 1C), aż poczwarka będzie całkowicie wolna od brązowej, nieprzezroczystej, kruchej osłonki (ryc. 1D).
      nuta: Poczwarki na tym etapie są bardzo delikatne i należy zachować ostrożność, aby nie przebić powierzchni poczwarki; Nakłucie jest oczywiste, ponieważ hemolimfa szybko wycieka z miejsca nakłucia. Poczwarki z nakłuciami, nawet małe, należy wyrzucić.
3. Zamontuj poczwarki w naczyniu ze szklanym dnem za pomocą kleju heptanowego.
   1. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 20 ml umieścić 10 ml kropli wstępnie przygotowanego kleju heptanowego (patrz sekcja 1.6 powyżej) w linii na naczyniu ze szklanym dnem.
   2. Pozostaw klej do wyschnięcia na 5 sekund przed ostrożnym przeniesieniem wypreparowanych poczwarek na klej heptanowy za pomocą kleszczy (ryc. 1E).
   3. Dla ułatwienia zranienia i obrazowania, ustaw poczwarki w rzędzie; sugeruje się około 5 poczwarek, ale więcej będzie można opanować z doświadczeniem.
      nuta: Stosowanie kleju heptanowego jest zalecane w przypadku korzystania z pionowych systemów obrazowania, ale nie jest konieczne w przypadku korzystania z systemu odwróconego. Jeśli klej tworzy aberracje optyczne podczas obrazowania, poczwarki można zamiast tego umieścić bezpośrednio na szkle nakrywkowym – naturalne przyleganie między tkanką poczwarki a szkłem będzie w większości przypadków wystarczające do stabilnego obrazowania, o ile zachowa się ostrożność podczas przesuwania czaszy obrazowania między mikroskopami.
4. Aby uzyskać najlepsze wyniki, zamontuj poczwarki tak, aby skrzydło przylegało płasko do szkła nakrywkowego, a większość powierzchni skrzydła miała bezpośredni kontakt ze szkłem nakrywkowym (rysunek 1F). Zwiń poczwarki za pomocą kleszczy, aby zmienić ich położenie, aby upewnić się, że skrzydło jest prawidłowo zamontowane.
5. Aby zapobiec odwodnieniu próbki w okresie obrazowania, na końcu montażu dodaj kawałek chłonnej bibuły filtracyjnej nasączonej wodą destylowaną na bok naczynia ze szklanym dnem, uważając, aby nie naruszyć poczwarek (ryc. 1E). Przykryj naczynie pokrywką.
   nuta: Poczwarki są teraz gotowe do zranienia i obrazowania.

3. Laserowe ranienie skrzydeł poczwarki Drosophila

1. Przenieść naczynie ze szklanym dnem zawierające zamontowane poczwarki do mikroskopu szerokokątnego wyposażonego w przestrajalny system ablacji laserowej.
   1. Użyj impulsowego lasera ablacyjnego chłodzonego powietrzem UV, pompowanego azotem, dostrojonego do 435 nm – szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów; dokładna długość fali światła używanego do oświetlenia jest wybierana przez użytkownika za pomocą odpowiedniego ogniwa barwnikowego.
2. Korzystając z optyki jasnego pola, wyreguluj elementy sterujące stolika mikroskopu, aby zlokalizować skrzydło poczwarki pierwszej poczwarki, która ma zostać zraniona (rysunek 1F).
3. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy używać soczewek obiektywowych z olejkiem 40X lub 63X zarówno do obrazowania, jak i do ablacji laserowej; upewnij się, że użyty płyn immersyjny (olej lub glicerol) jest spójny między systemami ablacji i obrazowania. Ustaw mikroskop tak, aby ustawił ostrość na płaszczyźnie nabłonka skrzydła poczwarki najbliżej szkiełka nakrywkowego (tj. ustaw ostrość na obszarze nabłonka, który ma zostać zraniony) za pomocą pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości.
4. Korzystając z regulacji stolika mikroskopu, ustaw skrzydło poczwarki tak, aby obszar, który ma zostać zraniony, był bezpośrednio wyrównany ze znanym obszarem docelowym lasera ablacyjnego.
5. Użyj szkiełka tłumiącego gęstość energii zamontowanego na mikroskopie, aby ręcznie wyregulować poziom mocy światła ablacyjnego.
   nuta: Suwak tłumika ma ograniczniki kliknięcia i liniały, które identyfikują względny poziom tłumienia i umożliwiają stosowanie powtarzalnych ustawień.
6. Korzystając z zewnętrznego ręcznego spustu, aktywuj laser ablacyjny za pomocą jednego krótkiego kliknięcia spustu, aby wykonać ranę. Sprawdź, czy w miejscu ablacji pojawił się przejściowy pęcherzyk powietrza, ponieważ zranieniu zwykle towarzyszy on. Sprawdź, czy zranienie wywołane laserem powiodło się, używając odpowiednich filtrów fluorescencyjnych do wizualizacji nabłonka poczwarki.
   nuta: Uważaj, aby uniknąć przypadkowego wystawienia na działanie wiązek laserowych, ponieważ odbicia wiązki mogą spowodować poważne uszkodzenie oczu lub skóry.
7. Jeśli zranienie się nie powiedzie, zmień płaszczyznę ogniskowej (przesuwając ostrość mikroskopu nieco powyżej lub poniżej bieżącego poziomu ogniskowej) i powtórz pojedyncze kliknięcie spustu ablacji. Alternatywnie, stopniowo zwiększaj moc lasera za pomocą suwaka tłumika, aż do uzyskania pożądanego rozmiaru rany.
8. Aby zmienić częstotliwość powtarzania impulsów lasera ablacyjnego, użyj pokrętła Częstotliwość powtarzania na tylnym panelu sterowania (które zmienia częstotliwość od mniej niż 1 impulsu/s do 60 Hz). Aby uzyskać optymalne nawijanie, ustaw częstotliwość powtarzania impulsów na 40 Hz.
9. Aby wygenerować rany o różnej wielkości, użyj suwaka tłumika gęstości energii, aby ręcznie dostosować poziom mocy światła ablacyjnego.
10. Powstrzymaj się od ranienia wszystkich dosiadanych poczwarek i używaj tych nieablowanych poczwarek jako niezranionych kontrol
.
11. Aby uzyskać spójne wyniki, należy regularnie ustawiać system ablacji (korzystając z odpowiedniej instrukcji obsługi). Wyczyść również i napełnij komórkę rezonatora barwnika, która kontroluje długość fali wyjściowej lasera.

4. Obrazowanie konfokalne in vivo w trybie poklatkowym

1. Szybko przenieś naczynie ze szklanym dnem do odpowiedniego mikroskopu w celu wykonania zdjęcia poklatkowego.
   nuta: Aby uzyskać optymalne wyniki, należy użyć mikroskopu konfokalnego lub wirującego dysku o wysokiej specyfikacji, wyposażonego w czułe detektory, które mogą wykryć zarówno zielone białko fluorescencyjne (GFP), jak i fluorofory mCherry.
2. Aby zobrazować całe skrzydło poczwarki, użyj soczewki obiektywu o małym powiększeniu (np. 20X) (ryc. 2A). Aby zobrazować gojenie się ran i towarzyszącą im reakcję zapalną z wysoką rozdzielczością przestrzenną, należy użyć soczewek obiektywowych 40X (NA 1.3) lub 63X (NA 1.4) (patrz reprezentatywne zdjęcia na rysunku 2B-D).
3. Otwórz odpowiednie oprogramowanie do przechwytywania obrazu skojarzone z mikroskopem.
4. Korzystając z oprogramowania do przechwytywania obrazu, włącz odpowiednie lasery, np. lasery 488 nm i 561 nm, aby uwidocznić odpowiednio fluorofory GFP i mCherry (klikając odpowiednie pola) i dostosuj moc lasera oraz ustawienia wzmocnienia/przesunięcia, aby uzyskać wystarczający sygnał fluorescencyjny, unikając nasycenia pikseli; użyj najniższej możliwej mocy lasera (w zakresie 5 - 20%), aby zminimalizować fotowybielanie i fototoksyczność.
5. Aby uchwycić zarówno naprawczy nabłonek, jak i rekrutację komórek zapalnych, ustaw mikroskop tak, aby rejestrował stos z za pomocą pokręteł precyzyjnej regulacji ostrości na panelu sterowania; Aby uzyskać optymalne wyniki, ustaw oprogramowanie (za pomocą ręcznych kliknięć przycisków) tak, aby rejestrowało plasterki Z przez skrzydło poczwarki (minimum co 3 mm), od góry uszkodzonego nabłonka do przestrzeni zewnątrzkomórkowej poniżej (zawierającej migrujące hemocyty), aby uzyskać duży stos Z (w zakresie 50 - 100 mm).
6. W przypadku obrazowania poklatkowego rejestruj stosy z w regularnych odstępach czasu (minimum co 30 s) przez co najmniej 1 godzinę po zranieniu.
   nuta: Dokładny odstęp czasu między wybranymi stosami Z stanowi kompromis między uchwyceniem szybko zmieniającej się dynamiki komórek a uniknięciem fotowybielania próbek.
7. Aby jednocześnie obrazować wiele poczwarek (w tym nieuszkodzone grupy kontrolne bez ablacji), należy użyć zmotoryzowanego stolika (dołączonego do mikroskopu) i funkcji akwizycji wielopozycyjnej dostępnej w oprogramowaniu do obrazowania. Ręcznie ustaw pozycję każdej poczwarki w oprogramowaniu za pomocą pokręteł regulacji pozycji sceny, a następnie ręcznie ustaw odpowiednie limity stosu z (góra i dół) dla każdej poczwarki.
8. Wizualizuj obrazy poklatkowe podczas przechwytywania obrazu lub później za pomocą specjalistycznego oprogramowania do analizy obrazu (takiego jak ImageJ) przy użyciu projekcji z-stack lub renderowania 3D. Na przykład, aby śledzić ruchy poszczególnych hemocytów (jak na rysunku 2C' i D'), śledź jądra hemocytów za pomocą ogólnodostępnych wtyczek ImageJ "TrackMate" lub "Manual Tracking" (metody opublikowane w).
9. Użyj sond fotokonwertowalnych (takich jak Kaede) do selektywnej fotokonwersji i znakowania podzbioru komórek nabłonkowych lub odpornościowych podczas obrazowania.
   1. Otwórz odpowiednie moduły w oprogramowaniu do obrazowania, aby przeprowadzić fotokonwersję (takie jak odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) i odzysk fluorescencji po fotowybielaniu) i aktywuj laser 405 nm (klikając odpowiednie pole oprogramowania).
   2. Wybierz komórki, które mają zostać fotokonwertowane w oprogramowaniu FRAP za pomocą narzędzia do zaznaczania kwadratowego, kołowego lub odręcznego. W oprogramowaniu FRAP ustaw przebieg czasowy fotokonwersji (wybielania) na pojedynczą iterację/klatkę i ustaw laser 405 nm na 20% mocy lasera. Ręcznie kliknij Rozpocznij eksperyment, aby przeprowadzić fotokonwersję.
   3. Wyjdź z modułu FRAP (kliknij Zamknij) i wróć do oryginalnego ekranu obrazowania w oprogramowaniu; użyj laserów 488 nm i 561 nm, aby zobrazować zachowanie komórek fotokonwertowanych i niefotokonwertowanych, konfigurując stos z i nagrywanie poklatkowe, jak powyżej.
      nuta: Fotokonwertowane sondy pozostają stabilne przez wiele godzin po początkowej fotokonwersji, umożliwiając śledzenie zachowania fotokonwertowanych komórek w czasie (przez co najmniej 5 godzin). Na przykład komórki zapalne w ranie mogą być selektywnie fotokonwertowane (ryc. 2F), a ich zachowanie można śledzić w miarę ustępowania z miejsca urazu (ryc. 2G i H).

Results

Rycina 1: Przygotowanie poczwarki Drosophila do zranień i obrazowania na żywo. (A) Białe poczwarki Drosophila zebrane w 0 h APF, z przednim końcem wskazanym przez kończyny oddechowe (przetchlinki). (B) Po wyhodowaniu białych przedpoczwarek APF 0h przez 18 godzin w temperaturze 25 °C, poczwarka wydaje się brązowa. Sekcja koperty poczwarki powinna ro...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stada Drosophila
Wszechobecna E-kadheryna oznaczona GFP; Ubi-p63E-shg.GFP; (Rozdział II)	Centrum Magazynowe w Kioto, DGRC	#109007	Sekwencje promotorowe Ubi-p63E napędzają ekspresję E-kadheryny Drosophila (strzelby) oznaczonej na końcu C-końcowym GFP.
Wszechobecna E-kadheryna znakowana GFP; Ubi-p63E-shg.GFP (III)	Centrum Hodowli Drosophila w Bloomington (Uniwersytet Indiana)	#58742	Sekwencje promotorowe Ubi-p63E napędzają ekspresję E-kadheryny Drosophila (strzelby) oznaczonej na końcu C-końcowym GFP.
Wszechobecny Moesin P{sGMCA}3.1 ze znacznikiem GFP	Centrum Hodowli Drosophila w Bloomington (Uniwersytet Indiana)	Numer katalogowy #59023	Wszechobecny ekspresja promotora/wzmacniacza sqh napędza ekspresję fragmentu Moesin (który zawiera sekwencje wiążące aktynę) oznaczonego GFPS65T.
Specyficzny dla hemocytów sterownik węża-Gal4 ; srp-Gal4;	Wygenerowane przez Katja Bruckner	Wygenerowane przez Katja Bruckner	Ekspresja Scer \ GAL4 połączonego z ogonem polyA jest kontrolowana przez 2 sekwencje genomowe od węża Drosophila. Patrz: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. Receptor PDGF/VEGF kontroluje przeżycie komórek krwi u Drosophila. Komórka deweloperska. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuklearnyRFP w1118; P{UAS-RedStinger}6	Centrum Hodowli Drosophila w Bloomington (Uniwersytet Indiana)	#8545 lub #8547	Sekwencje regulacyjne UAS napędzają ekspresję postaci zapytania ofertowego DsRed.T4, która jest oznaczona na końcu C-końcowym sygnałem lokalizacji jądrowej
UAS-cytoplazmatyczny GFP ;; P{UAS-GFP. S65T}	Centrum Hodowli Drosophila w Bloomington (Uniwersytet Indiana)	Dostępnych jest wiele akcji (np. #1522)	Ekspresja wersji S65T GFP przez sekwencje regulacyjne UAS; wariant S65T wykazuje zwiększoną jasność.
UAS-photoconvertibleKaede w1118; P{UAS-Kaede.A}3	Centrum Hodowli Drosophila w Bloomington (Uniwersytet Indiana)	#26161	Białko Kaede po syntezie emituje jasnozieloną fluorescencję, ale po naświetlaniu promieniowaniem UV zmienia się efektywnie w jasną, stabilną czerwoną fluorescencję.
Dynia spaghetti z GFP w1118; P{sqh-GFP.RLC}	Centrum Hodowli Drosophila w Bloomington (Uniwersytet Indiana)	#57145	Region kodowania sqh, który jest oznaczony na końcu C-terminala znacznikiem T:Avic\GFPS65T, jest wyrażany pod kontrolą naturalnego promotora sqh.
Składniki na podłoża pokarmowe dla much			Pożywki pokarmowe dla much są wytwarzane zgodnie ze standardowymi procedurami (patrz Greenspan, R. 1997. Pchanie much: teoria i praktyka genetyki Drosophila. Cold Spring Harbor Press. 1-191 str.)
kukurydza	Wild Oats, Bristol, Wielka Brytania (lub równoważny dostawca)	Skontaktuj się bezpośrednio z dostawcą	organiczny
Mąka sojowa	Wild Oats, Bristol, Wielka Brytania (lub równoważny dostawca)	Skontaktuj się bezpośrednio z dostawcą	organiczny
Ekstrakt słodowy	Wild Oats, Bristol, Wielka Brytania (lub równoważny dostawca)	Skontaktuj się bezpośrednio z dostawcą	organiczny
melasa	Wild Oats, Bristol, Wielka Brytania (lub równoważny dostawca)	Skontaktuj się bezpośrednio z dostawcą	organiczny
Agar Difco	BD Nauki Biologiczne, Fisher Scientific	DF0142-15-2	Do przygotowania pokarmu dla much
Kwas propionowy	Sigma	402907	Do przygotowania pokarmu dla much
Nipagen powiedział:	Sigma	Numer telefonu 79721	Do przygotowania pokarmu dla much
Suszone drożdże piekarskie	Redstar, Dutscher Scientific, Wielka Brytania LTD	Redstar, Dutscher Scientific, Wielka Brytania LTD	Do przygotowania pokarmu dla much
Przygotowanie i montaż próbki
Parafilm	Sigma	Zobacz materiał P7793-1EA	Do przygotowania kleju heptanowego
Drobny pędzel sobolowy	Daler-Rowney (lub odpowiednik)	#0 lub 1
Kleszcze	Fisher Scientific (lub Narzędzia Nauk Pięknych)	NC9404145	Dumont #5
Naczynia ze szklanym dnem do obrazowania	MatTek	P35G-0-10-C	Sugerujemy użycie szalek Petriego o średnicy 35 mm, z co najmniej 10-milimetrową szklanką Microwell, 0,085-0,13 mm, niepowlekaną. Szalki z większymi mikrostudzienkami umożliwią montowanie i obrazowanie coraz większej liczby poczwarek w jednym eksperymencie.
heptan	Sigma	51730-5ML	Do przygotowania kleju heptanowego
Dwustronna taśma klejąca (np. klejąca)	Agar Naukowy	AGG263	Do przygotowania kleju heptanowego
Tubka 50ml (na klej heptanowy)	Rurki Falcon firmy Fisher Scientific	Numer katalogowy: 14-432-22	Do przygotowania kleju heptanowego
Szkiełka mikroskopowe szklane	Agar Naukowy	AGL4244	Do preparacji poczwarek Drosophila
Mikroskop preparacyjny stereoskopowy z jasnym polem	Leica (lub odpowiednik)	Zobacz materiał M50	Do preparacji poczwarek Drosophila
Mikronożyczki	Międzynarodowy Port Lotniczy im. Johna Weissa	103123	Miniaturowe nożyczki badawcze (proste)
Ablacja laserowa i obrazowanie
Laser ablacyjny nitogenowy	Spectra-Physics (lub odpowiednik Andor)	modelu VSL-337ND-S	W przypadku zranień należy go podłączyć do systemu obrazowania szerokokątnego
Wielolaserowy konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop (CLSM)	Leica (lub odpowiednik)	TCS AOBS SP8 lub SP5-II podłączony do mikroskopu odwróconej epifluorescencji Leica DMi8 (lub jego odpowiednika)	Idealnie wyposażony w zmotoryzowany stolik do skanowania wielomiejscowego i "mozaikowego" oraz "hybrydowe" detektory GaAsP (które oferują znacznie większą czułość i wzmocnienie słabego sygnału)
Komora środowiskowa	Usługi obrazowania życia (lub równoważne)	"System kontroli temperatury mikroskopu"	Dołączony do mikroskopu konfokalnego do kontroli temperatury podczas obrazowania
Oprogramowanie do analizy obrazu
Moduł oprogramowania FRAP	Leica (lub odpowiednik)	Moduł oprogramowania CLSM FRAP	Do przeprowadzania fotokonwersji fluoroforów fotokonwertowalnych, takich jak Kaede
ImageJ (oprogramowanie do analizy obrazu)	Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A., Rasband, WS, Eliceiri, KW "NIH Image to ImageJ: 25 lat analizy obrazu". Metody natury 9, 671-675, 2012.
Wtyczka ImageJ "Śledzenie ręczne"	Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
Wtyczka ImageJ "TrackMate"	ImageJ, NIH	https://imagej.net/TrackMate	Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. i in. (2016), "TrackMate: Otwarta i rozszerzalna platforma do śledzenia pojedynczych cząstek.", Metody 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (wysokowydajne oprogramowanie do obrazowania 3D)	Perkin Elmer	Objętość 6,3	Do analizy obrazu
IMARIS (oprogramowanie do analizy obrazu)	Płaszczyzna bitowa	IMARIS dla biologów komórkowych	Do analizy obrazu