Test adherencji opsonowej do oceny opsonizacji bakterii otoczkowanych przez przeciwciała antykapsułkowe

Streszczenie

Źródło: Chua, J., et al. Test przestrzegania zaleceń opsonowych w celu oceny funkcjonalnych przeciwciał w rozwoju szczepionki przeciwko Bacillus anthracis i innym patogenom kapsułkowanym. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje test opsono-adherencji do badania interakcji między opsonizowanymi bakteriami a komórkami odpornościowymi. Bakterie znakowane fluorescencyjnie, potraktowane surowicą testową zawierającą przeciwciała antykapsułkowe, inkubuje się z makrofagami. Po zabarwieniu makrofagów fluorescencją, przyczepione bakterie na powierzchni makrofagów obserwuje się pod mikroskopem w celu wizualizacji.

Protokół

1. Hodowla i preparaty bakteryjne

UWAGA: Gatunek bakterii użyty w tym protokole to zamknięty w kapsułkach zjadliwy szczep, B. anthracis Ames. Wszystkie manipulacje z tym gatunkiem wymagają odpowiednich poświadczeń bezpieczeństwa biologicznego i ochrony oraz muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II lub III znajdującej się w laboratorium BSL-3. Postępuj zgodnie z instytucjonalnymi procedurami operacyjnymi dotyczącymi pracy BSL-3 i stosowania środków ochrony osobistej podczas obchodzenia się z bakteriami.

1. Przygotować bulion z naparu z serca mózgu (BHI), rozpuszczając 37 g proszku BHI w 1 l wody i sterylizując w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Przechowuj bulion w temperaturze otoczenia.
2. Przygotować 8% roztwór wodorowęglanu sodu w wodzie i wysterylizować za pomocą strzykawki filtrującej 0,20 μm. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 dnia.
3. Wymieszaj 8 g bulionu odżywczego, 3 g ekstraktu drożdżowego i 15 g agaru w 1 l wody, aby przygotować płytki agarowe NBY. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min. Wlać do szalek Petriego i pozostawić do zestalenia. Przechowywać talerze w temperaturze 4 °C.
   nuta: Płytki agarowe NBY mogą być wykonane z wodorowęglanem sodu lub bez. Dodanie wodorowęglanu sodu do bulionu i płytek agarowych indukuje wzrost kolonii śluzów składających się z kapsułkowanych pałeczek. Końcowe stężenie wodorowęglanu sodu zarówno w środowisku ciekłym, jak i stałym wynosi 0,8%.
4. Przygotuj bulion hodowlany dla B. anthracis, mieszając 50% autoklawizowanego bulionu BHI, 40% FBS i 10% roztworu wodorowęglanu sodu (v / v).
   nuta: Ten bulion został opracowany do wytwarzania krótkich łańcuchów zamkniętych w kapsułkach pałeczek.
5. Przygotuj płytkę wzorcową B. anthracis, rozsypując ją w celu wyizolowania na płytce agarowej NBY z wywaru z zarodników na jeden dzień przed hodowlą w bulionie. Inkubować w temperaturze 37 °C.
6. Zaszczepić 30 ml bulionu hodowlanego w wentylowanej kolbie o pojemności 250 ml kilkoma koloniami B. anthracis.
   nuta: Określony stosunek objętości do powierzchni bulionu, jak określono tutaj, jest potrzebny do wytworzenia maksymalnie zamkniętych pałeczek.
7. Wstrząśnij kulturą bulionową przy 125 obr./min, 37 °C z 20% CO₂ i wilgotnością przez 18–24 h.
   nuta: Uprawa B. anthracis w temperaturach wyższych niż 37 °C może hamować produkcję kapsułek.
8. Stosować barwienie negatywowe tuszem indyjskim, aby zapewnić wystarczającą enkapsulację i to, że pałeczki są w krótkich łańcuchach (1–5 pałeczek / łańcuch) przed utrwaleniem (patrz punkt 2).
9. Aby oznaczyć jednostki tworzące kolonie (CFU), należy seryjnie rozcieńczyć 100 μl kultury w stosunku 1:10 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i rozcieńczyć kultury na płytkach agarowych z krwią owczą. Inkubować przez 12–18 godzin w temperaturze 37 °C. Policz jtk i oznacz liczbę bakterii na ml hodowli.
   nuta: Liczenie można również przeprowadzić za pomocą hemocytometru pod mikroskopem po utrwaleniu bakterii. Nie jest to jednak zalecane, ponieważ pałeczki są trudne do zauważenia w małym powiększeniu.
10. Dodać 16% paraformaldehydu (PF) do całej objętości kultury bakteryjnej o końcowym stężeniu 4% PF, aby utrwalić pałeczki. Powoli mieszać na wytrząsarce w temperaturze otoczenia przez 7 dni.
    nuta: Siedmiodniowa inkubacja w 4% PF opiera się na instytucjonalnej standardowej procedurze operacyjnej Instytutu Badań Medycznych Chorób Zakaźnych Armii Stanów Zjednoczonych (USAMRIID) w celu utrwalenia pałeczek wegetatywnych.
11. Aby usunąć utrwalacz i sprawdzić sterylność, należy trzykrotnie przemyć 4 ml (10% objętości) utrwalonej zawiesiny bakteryjnej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przez odwirowanie przy ≥3000 x g przez 45 minut i przy użyciu 30 ml / przemycie z PBS. Pozostałą próbkę przechowywać w 4% PF w temperaturze 4 °C.
    nuta: Po granulowaniu granulat bakteryjny jest puszysty ze względu na obecność kapsułki. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu podczas prania. Konieczne jest usunięcie wszystkich utrwalaczy, aby nie przeszkadzały one w badaniu żywotności. W razie potrzeby zwiększ liczbę prań.
12. W celu zbadania żywotności zaszczepić 40 ml bakteryjnej pożywki hodowlanej (np. bulionu BHI) 4 ml przemytej zawiesiny (≤ 10% objętości bulionu) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 dni. Sprawdź gęstość optyczną przy 600 nm przed i po 7 dniach, aby zmierzyć zmętnienie.
13. Po 7 dniach inkubacji w kulturze bulionowej ≥100 μl bulionu należy umieścić na płytce agarowej i inkubować przez kolejne 7 dni. Jeśli nie obserwuje się wzrostu zmętnienia ani wzrostu na płytkach, oryginalna kultura jest uważana za sterylną i może zostać przeniesiona do laboratorium BSL-2.
    UWAGA: Federalny program Select Agent nakazuje, aby inaktywowany B. anthracis mógł być przenoszony z laboratoriów BSL-3 tylko po wykazaniu całkowitej sterylności próbki. Badanie żywotności inaktywowanego B. anthracis polega na hodowli 10% próbki w bulionie przez 7 dni, a następnie hodowli na stałym podłożu przez kolejne 7 dni. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucji, aby otrzymać zgodę na transfer po ustaleniu sterylności.         

2. Barwienie ujemne i mikroskopia świetlna do obserwacji enkapsulacji i łańcuchów pałeczek

1. Wymieszaj 5 μl zawiesiny bakteryjnej z 2 μl tuszu indyjskiego na szkiełku mikroskopowym. Umieść szkło nakrywkowe o grubości 1 lub 1,5 μm na wierzchu zawiesiny, nie tworząc pęcherzyków.
   nuta: Lakier do paznokci może być użyty do uszczelnienia szkła nakrywkowego na szkiełku.
2. Obserwuj zawiesinę bakteryjną za pomocą soczewki obiektywu olejowego od 40x do 100x pod mikroskopem świetlnym. Upewnij się, że pałeczki są otoczone kapsułkami, obserwując strefę odstępu (kapsułka nie obejmuje atramentu indyjskiego) otaczającą każdą bakterię i że łańcuchy prątków są krótkie.

3. Etykietowanie FITC bakterii

1. Rozpuścić izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) w dimetylosulfotlenku w stężeniu 2 mg/ml.
2. Zmierz objętość inaktywowanego materiału bakteryjnego.
3. Umyj bulion 3x w PBS, aby usunąć utrwalacz.
4. Dodać roztwór FITC o końcowym stężeniu 75 μg/ml. Mieszaninę powoli mieszać przez 18–24 godziny w temperaturze 4 °C.
5. Trzykrotnie umyj bakterie, granulując w ≥3000 x g, 45 minut i używając 30 ml PBS/pranie, aby usunąć nadmiar FITC. Upewnij się, że puszysty pellet nie jest naruszony podczas prania. Ponownie zawiesić pałeczki w PBS przy tej samej objętości początkowej.
6. Porcję i przechowywać pałeczki w mikroprobówkach w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Nie zamrażaj/nie rozmrażaj pałeczek wiele razy, ponieważ pałeczki mogą stracić kapsułkę.

4. Opsonizacja bakteryjna

1. Ogrzewać dezaktywować niewielką objętość badanych surowic (pochodzących od naczelnych innych niż ludzie) w temperaturze 56 °C przez 30 minut w bloku cieplnym.
2. Rozmrozić i umyć bakterie znakowane FITC za pomocą PBS 2x, granulując w ilości 15000 x g przez 3–5 minut. Ponownie zawiesić w PBS przy tej samej objętości początkowej.
3. W 96-dołkowej okrągłej płytce dolnej (płytka #2) seryjnie rozcieńczyć surowice testowe w pożywce komórkowej. Na innej 96-dołkowej okrągłej płytce dolnej (płytka #3) dodaj 10 μl rozcieńczonych surowic testowych do każdej studzienki.
   nuta: Na każdej płytce PBS i normalne surowice małpie zostały włączone zamiast rozcieńczonych surowic testowych jako kontrole ujemne. Wybraliśmy również jedną surowicę testową jako kontrolę pozytywną, aby wygenerować krzywą standardową w celu normalizacji wszystkich testów wykonanych w różnych dniach. Surowica do badania kontrolnego dodatniego została wybrana arbitralnie, ponieważ było jej dużo.
4. Na talerz #3 dodaj 10 μl świeżo rozpuszczonego dopełniacza dla młodego królika.
   nuta: Po rozpuszczeniu wyrzucić pozostały dopełniacz małego królika; Nie zamrażać ponownie i nie rozmrażać.
5. Do tabliczki #3 dodaj odpowiednią objętość pałeczek znakowanych FITC dla wielokrotności infekcji 1:20. Na przykład dodaj wolumin zawierający 5 x 10⁴ x 20 pałeczek dla 5 x 10⁴ komórek. Uzupełnij każdą studzienkę na płytce #3 odpowiednią objętością pożywki komórkowej, aby uzyskać łącznie 105 μL.
   nuta: Płytka #1, która zawiera komórki, otrzymuje 100 μl opsonizowanych bakterii, a pozostałe 5 μl stanowi objętość pustki. Przetestowaliśmy każde rozcieńczenie badanych surowic w dwóch egzemplarzach.
6. Inkubować płytkę #3 w temperaturze 37 °C przez 30 minut w obecności 5% CO₂ z wilgotnością w celu opsonizacji pałeczek.

5.Test przestrzegania zaleceń lekarskich i fluorescencyjne znakowanie komórek ssaków

1. Przed użyciem wszystkie odczynniki należy utrzymywać w temperaturze 37 °C.
2. Umieść płytkę #1, która zawiera przylegające komórki, na bloku grzewczym o temperaturze 37 °C.
3. Użyj pipety wielokanałowej, aby usunąć zużyte podłoże ze studzienek i szybko zastąp je 100 μl opsonizowanych bakterii z płytki #3. Upewnij się, że podczas pipetowania w studzienkach nie powstały pęcherzyki. Inkubować płytkę #1 w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i wilgotnością przez 30 minut w celu przestrzegania zaleceń.
4. Umyj każdą studzienkę 5x 150 μl PBS na wierzchu bloku grzewczego o temperaturze 37 °C, aby usunąć nieprzyczepione pałeczki.
   nuta: Należy uważać, aby komórki nie zostały przypadkowo rozproszone podczas mycia.
5. Rozcieńczyć 16% PF PBS w stosunku 1:4, aby uzyskać 4% PF. Utrwalić komórki 4% PF przez 1 godzinę, dodając 150 μl do każdej studzienki. Umyj komórki 2x PBS.
6. Wymieszaj 2 μl HCS (badanie przesiewowe o wysokiej zawartości) barwienia krwinkami pomarańczy w 10 ml PBS. Dodać 150 μl tego roztworu barwiącego do utrwalonych komórek i inkubować przez 30 minut w temperaturze otoczenia.
7. Umyj studzienki 2x za pomocą PBS.
8. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania mikroskopii.

6. Mikroskopia

UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wysokowydajny zautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny ułatwi obrazowanie dla OAA. Jeśli zautomatyzowany system nie jest dostępny, można ręcznie wykonać obrazy fluorescencyjne przylegających pałeczek. W tym badaniu przylegające pałeczki i monowarstwy komórkowe zobrazowano za pomocą systemu laserowej mikroskopii skaningowej Zeiss 700 ze specjalistycznym sprzętem; nasz system składał się z mikroskopu odwróconego Zeiss Axio Observer Z1 wyposażonego w stolik automatyczny, modułu Definite Focus, obiektywu 40 x NA 0,6, kamery Axio Cam HRc oraz oprogramowania Zen 2012 (Blue Edition). Uzyskane obrazy są obrazami szerokokątnymi, a nie konfokalnymi. Poniższy protokół ma na celu podstawową konfigurację mikroskopu, która ma zastosowanie do różnych zautomatyzowanych systemów mikroskopowych.

1. Inkubować płytkę #1 w temperaturze otoczenia przez 30 minut. Włączyć mikroskop i związany z nim sprzęt.
   nuta: Aklimatyzacja w temperaturze otoczenia zapobiega tworzeniu się kondensatu na szklanej płycie podczas obrazowania. Ponadto zapobiega rozmyciu spowodowanemu zmianami temperatury.
2. Umieść płytkę na stole montażowym i skup się na komórkach, używając jasnego pola lub kontrastu fazowego.
3. Wybierz format 96 dołków jako ustawienie płytki. Wybierz ustawienia kanału.
   nuta: Szczytowa długość fali wzbudzenia i emisji FITC wynosi 495/519 nm; barwienie pomarańczowych komórek HCS wynosi 556 i 572 nm. Inne fluorofory mogą być używane w zależności od filtrów dostępnych w mikroskopie.
4. Wybierz ustawienie na Tryb kafelków. Wskaż liczbę obrazów, które mają zostać pobrane.
   nuta: Funkcja kafelkowania umożliwia uchwycenie wielu lokalizacji w dołku próbki i może być ustawiona tak, aby uzyskać obraz w formacie kafelkowym lub losowym. Zobrazowaliśmy 10 losowych obszarów na studnię.
5. Zmień tryb akwizycji na "czarno-biały" lub "monochromatyczny" i binning ≥ 2x2.
   nuta: Ustawienie binningu z 1x1 na 2x2 lub 4x4 zwiększyłoby szybkość mikroskopii, ale skutkowałoby również niższą rozdzielczością obrazu. W przypadku OAA wystarczy użyć tych ustawień, ponieważ test zlicza zarówno makrofagi, jak i przylegające bakterie.
6. Włącz autofokus lub moduł ustawiania ostrości. Wskaż, jak często ma być wykonywana funkcja autofokusa. Włącz funkcję stosu Z, jeśli jest dostępna. Wskaż liczbę stosów Z, które uchwycą grubość monowarstwy komórek i przylegających pałeczek.
   nuta: Wybrana liczba stosów Z wydłuży czas mikroskopii, ale zapewni, że obraz z prawidłową ostrością zostanie wykonany na każdym stosie Z.
7. Wyznacz folder plików, w którym chcesz zapisywać obrazy. Uruchom program do automatycznego obrazowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr strzykawkowy 0,20 μm (25 mm, regenerowana celuloza)	Corning, Corning, Nowy Jork	431222
Strzykawka 10 ml (końcówka Luer-Lock)	BD, Franklin Lakes, Nowy Jork	302995
Czarne płytki 15μ 96 dołków (płytka #1 do obrazowania)	In Vitro Scientific, Sunnyvale, Kalifornia	P96-1-N
16% paraformaldehyd	Mikroskopia elektronowa, Hatfield, Pensylwania	Numer katalogowy: 15710
75 cm kw. kolba poddana hodowli tkankowej	Corning, Corning, Nowy Jork	430641
Agar (proszek)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A1296
Uzupełnienie dla małego królika	Cedarlane Labs, Burlington, Karolina Północna	Zobacz materiał CL3441
Ekstrakt z drożdży Bacto	BD, Iskry, MD	Numer katalogowy: 288620
BBL Napar z serca mózgu (BHI)	BD, Iskry, MD	211059
Talerze z agarem z krwią (TSA z krwią owczą)	Remel, Lenexa, KS	Czynnik R01198
Skrobak do komórek	Sarstedt, Newton, Karolina Północna	83 183
Płytki do hodowli komórkowych Costar 96 dołków (płytki #2 i 3 do rozcieńczeń)	Corning, Corning, Nowy Jork	3596
Szkło nakrywkowe	Mikroskopia elektronowa, Hatfield, Pensylwania	Nr kat. 72200-10
Bulion odżywczy Difco	BD, Iskry, MD	Numer katalogowy: 234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka glukoza	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts	11965-092	Zawiera 4500 mg/L glukozy, 4 mM L-glutaminy, czerwień fenolową
EVOS FL Auto Cell Imaging System (mikroskop fluorescencyjny)	Technologie życia, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts	AMAFD1000
Surowica bydlęca płodu	Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT	SH30071.03	Nie napromieniowane promieniami gamma, nie dezaktywowane termicznie
Izotiocyjanian fluoresceiny	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts	Zobacz materiał F143
HCS Cell Mask Pomarańczowa plama komórkowa	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts	Zobacz materiał H32713
hemocytometr (ulepszony Neubauer)	Hausser Scientific, Horsham, Pensylwania	3900
Indyjskie rozwiązanie atramentowe	BD, Iskry, MD	261194
L-glutamina (200 mM)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA	25030081	Uzupełnij pożywkę o dodatkowe 2mM L-glutaminę
Nikon Eclipse TE2000-U (odwrócony mikroskop złożony)	Nikon Instruments, Melville, Nowy Jork	Pakiet TE2000
PBS bez wapnia i magnezu	Lonza, Walkersville, Maryland	17-516F
Roztwór penicyliny i streptomycyny, 100x	Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT	SV30010
Szalki Petriego (100 x 15 mm)	Sokół, Corning, Durham, Karolina Północna	351029	Na płytki agarowe
Linia komórkowa makrofagów RAW 264.7 (Tib47)	ATCC, Manassas, Wirginia	ATCC TIB-71
Slajdów	VWR, Radnor, Pensylwania	Numer katalogowy: 16004-422
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Zobacz materiał S5761
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Zobacz materiał T8154
Laserowy mikroskop skaningowy Zeiss 700 (mikroskop konfokalny)	Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, Nowy Jork	4.109E+15