Ocena kontrolowanej aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu MHC

Streszczenie

Źródło: Sanchez, E., et al. Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty. J. Vis. Exp. (134), (2018)

Ten film demonstruje metodę dedukowania fotoaktywowanego kompleksu zgodności tkankowej peptydowego za pomocą promieniowania UV. Proces degeneracji odsłania natywną sekwencję peptydową, umożliwiając precyzyjną aktywację limfocytów T.

Protokół

1. Przygotowanie stymulujących powierzchni szklanych

1. Pokryj szkło nakrywkowe z ośmiokomorową biotynylowaną poli-L-lizyną (Bio-PLL) rozcieńczoną w stosunku 1:500 w destylowanej, dejonizowanej wodzie (ddH₂O). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
2. Umyć za pomocą_H2O.
3. Suszyć przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Powierzchnie pokryte Bio-PLL należy zablokować buforem blokującym (sól fizjologiczna buforowana przez HEPES [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], z 2% BSA) przez 30 min w temperaturze pokojowej.
   1. Rozpuścić 5 mg bromowodorku poli-L-lizyny w 1 ml 10 mM NaPO4 o pH 8,5.
   2. Dodać 125 μmol (0,55 mg) NHS-biotyny (z zapasu 100 mg/ml w DMSO) i sprawdzić pH reakcji. Jeśli pH jest poniżej 8,5, dodaj 2 μl 4 N NaOH, aby podnieść je do pH między 8,5 a 9,5.
   3. Wiruj przez 30 minut.
   4. Ugasić reakcję 50 μl 100 mM glicyny rozpuszczonej w 20 mM Tris pH 8,0.
   5. Wirować z pełną mocą przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki.
      UWAGA: Jakość Bio-PLL jest zwykle porównywana z poprzednimi preparatami poprzez seryjne dwukrotne rozcieńczenia materiału na 96-dołkowej płytce ELISA i ilościowe określenie zawartości biotyny po inkubacji streptawidyną sprzężoną z fosfatazą alkaliczną.
5. Usuń bufor blokujący. Nie dopuścić do wyschnięcia studzienek. Dodać streptawidynę (100 μg/ml w buforze blokującym). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
6. Umyć w HBS. Napełnij i odwróć studzienki przesuwne komory 4 - 5 razy, usuwając HBS ze studzienek. Nie dopuścić do wyschnięcia studzienek.
7. Dodaj biotynylowane ligandy pMHC i cząsteczki adhezyjne na powierzchnię.
   nuta: MCC i OVA mogą być fotoklatowane poprzez dodanie grup ochronnych na bazie orto-nitrobenzylu (np. nitrofenyloetylu (NPE) lub nitroweratryloksykarbonylu (NVOC)) do grupy ε-aminowej kluczowych lizyn (K12 w MCC, K7 w OVA). Fotoklatki MCC i OVA można uzyskać od komercyjnych dostawców. Po rozpuszczeniu w buforze wodnym są one ponownie składane do ulegających ekspresji bakteryjnej I-E^k i H2-K^b przy użyciu ustalonych metod.
8. Walidacja fotoaktywowanego peptydu MCC lub OVA
   1. Usuwanie peptydów chronionych przez NVOC poprzez naświetlanie promieniami UV za pomocą ręcznej lampy UV (patrz tabela materiałów) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Pulsować 1,0 x 10⁵ APC z 1 μM peptydu niestymulującego (kontrola ujemna, np. Hb), nienapromieniowanego peptydu fotoaktywowanego, napromieniowanego peptydu fotoaktywowanego i peptydu agonistycznego (kontrola pozytywna, np. MCC) przez 1 godzinę do nocy w temperaturze 37 °C.
   3. Aby stymulować limfocyty T wyrażające 5C. C7 / 2B4 / I TCR, użyj komórek CH12 lub CH27 B. Aby stymulować limfocyty T OT1, użyj komórek grasiczaka RMA-s lub EL4.
   4. Zmieszać pulsacyjne APC z równą liczbą limfocytów T w 96-dołkowych płytkach o okrągłym dnie w końcowej objętości 200 μl. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-24 godziny.
   5. Odzyskać supernatanty z każdej studzienki i przeanalizować IL-2 za pomocą testu ELISA z detekcją kolorymetryczną streptawidyny i peroksydazy chrzanowej.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się potwierdzenie statusu chowania wszystkich peptydów za pomocą spektrometrii mas z elektrorozpylaniem przed ponownym fałdowaniem do kompleksów MHC.
9. Wykonaj składanie i oczyszczanie MHC, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Na przykład, owiń reakcje fałdowania w folię aluminiową i przeprowadź chromatografię filtracji żelowej przy wyłączonej lampie UV.
   nuta: Stwierdzono, że fotoaktywowane MCC-I-E^k i OVA-H2-K^b indukują niezależną od UV aktywację limfocytów T przy dużej gęstości, prawdopodobnie z powodu niepełnego funkcjonalnego klatkowania. W związku z tym fotoaktywowany pMHC jest rozcieńczany do 10-30-krotnego nadmiaru niestymulującego pMHC (np. ^{I-E k} zawierającego peptyd hemoglobiny (Hb)) na etapie immobilizacji. Zwiększa to stosunek sygnału do szumu w kolejnym eksperymencie obrazowania.
10. Aby fotoaktywować limfocyty T CD4 ⁺, należy wspólnie użyć mieszaniny biotynylowanego Hb-I-Ek (3 μg / ml), biotynylowanego fotoaktywowanego MCC-I-E^k (0,1 μg / ml) i biotynylowanego przeciwciała przeciwko MHC klasy I H2-K^k (0,5 μg / ml). Przeciwciało anty-H2-K^k zachęca do 5C. Limfocyty C7/2B4/I T, które eksprymują H2-K^k, rozprzestrzeniają się na powierzchnię szkła bez poddawania się aktywacji.
11. W przypadku limfocytów T CD8 ⁺ należy użyć mieszaniny biotynylowanego H2-Db zawierającego peptyd KAVYDFATL (1 μg / ml), biotynylowanego fotoaktywnego OVA-H2-Kb (0,1 μg / ml) i domeny zewnątrzkomórkowej cząsteczki adhezyjnej ICAM-1 (2 μg / ml wytwarzane przez hodowlę komórek owadów). ICAM-1 zachęca do tworzenia bliskiego kontaktu poprzez angażowanie integryny LFA1 na powierzchni limfocytów T.
12. Umieścić wszystkie mieszaniny białek w buforze blokującym, a następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    nuta: Gęstość cząsteczkowa na tego rodzaju powierzchniach wynosząca ~8000 na μm2 została już wcześniej określona. Biorąc pod uwagę, że fotoaktywowany pMHC stanowi ~1/30 biotynylowanego białka na powierzchni, jego gęstość wyniesie ~267 cząsteczek na μm2, przed delegacją.
13. Umyć jak w kroku 1.6 i pozostawić w HBS do momentu użycia.
14. Dodać 200 000 limfocytów T CD4 ⁺ lub CD8 ⁺ wyrażających odpowiedni TCR do każdej studzienki i pozostawić komórkom do przylegania w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Gdy komórki przyczepią się do powierzchni i rozprzestrzenią się na niej, są gotowe do fotoaktywacji i obrazowania.
    nuta: Transdukcja retrowirusowa efektorowych limfocytów T za pomocą fluorescencyjnych sond obrazowania jest szczegółowo opisana w innym miejscu. Sygnalizację wapniową można również badać za pomocą nietransdukowanych limfocytów T obciążonych wrażliwym na wapń barwnikiem Fluo-46. Barwnik ratiometryczny Fura-2 nie jest zalecany, ponieważ wymaga wzbudzenia w zakresie UV, co również indukuje deaging fotoaktywowanego pMHC.

2. Akwizycja obrazu

1. Do akwizycji obrazu należy użyć odwróconego mikroskopu TIRF wyposażonego w soczewkę obiektywową 150X zgodną z promieniowaniem UV. Naświetlanie promieniami UV obszarów zdefiniowanych przez użytkownika za pomocą cyfrowego systemu membran podłączonego do lampy rtęciowej o mocy 100 W (HBO). Skierować światło UV z tej lampy na próbkę za pomocą lustra o długości fali 400 nm.
2. Korzystaj z oprogramowania do analizy obrazu do zlokalizowanej fotoaktywacji i akwizycji poklatkowej. W większości eksperymentów monitoruj sondy zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym, używając odpowiednio laserów wzbudzających 488 nm i 561 nm. Światło lasera jest kierowane na próbkę za pomocą dwupasmowego zwierciadła dichroicznego, które transmituje również w zakresie UV (aby umożliwić deklarację). Proszę zapoznać się z tabelą materiałów i rysunkiem 1, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat konfiguracji mikroskopu.
3. Po zamontowaniu szkiełka komory zawierającego limfocyty T, w razie potrzeby wyreguluj ustawienia, aby uzyskać oświetlenie TIRF lub epifluorescencyjne. W trybie na żywo wybierz pole komórek, które wyrażają interesujące nas sondy fluorescencyjne. Ustal obszary w skali mikronowej do fotoaktywacji pod pojedynczymi komórkami za pomocą sterowania programowego.
4. Rozpocznij akwizycję poklatkową. Zazwyczaj uzyskuje się 80 punktów czasowych w odstępie 5 s między każdym punktem czasowym. Pozostawia to więcej niż wystarczająco dużo czasu na sekwencyjne ekspozycje 488 nm i 563 nm, w przypadku eksperymentów z dwoma kolorami.
5. Po upływie 10 punktów czasowych fotoaktywuj wybrane obszary, otwierając cyfrową migawkę przysłony na 1 - 1,5 s.
6. Po zakończeniu tworzenia filmu poklatkowego wybierz nowe pole komórek i powtórz proces.

Wyniki

Rysunek 1: Konfiguracja mikroskopu do fotoaktywacji i obrazowania TIRF.

488 nm i 561 nm lasery są używane do obrazowania TIRF i epifluorescencji odpowiednio zielonych i czerwonych sond. Światło UV do fotoaktywacji jest pobierane z lampy rtęciowej (Hg) podłączonej do cyfrowego systemu membranowego zdolnego do oświetlania małych, zdefiniowanych przez użytkownika obszarów. Ś...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nunc Lab-Tek Komorowa szklana osłona	Thermofischer Naukowy	155361
Bromowodorek poli-L-lizyny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P2636	Będzie musiał wytworzyć biotynylowaną poli-L-lizynę
EZ-Link NHS-Biotyna	Thermofischer Naukowy	Rok 20217	Będzie musiał wytworzyć biotynylowaną poli-L-lizynę
Streptawidyna	Thermofischer Naukowy	434301
BirA-500: Standardowy zestaw reakcyjny ligazy biotynowo-białkowej BirA	Zachłanność	BirA500	Będzie stosowany do biotynylacji białek
Biotynylowany Hb I-EK			Informacje na temat fałdowania białek znajdują się w odnośniku 6. Do biotynylacji użyj zestawu BirA
Biotynylowany NPE-MCC I-EK	Anaspec		Niestandardowy NPE-MCC (HANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATKOH) można kupić w Anaspec
Biotynylowane przeciwciało αH2-Kk	BD Nauki biologiczne	553591
Biotynylowany NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		Niestandardowe NPE-OVA (H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH) można kupić w Anaspec
Biotynylowany KAVY H2-DB	Anaspec		Niestandardowe syntetyzowane białko (KAVYDFATL) można kupić w Anaspec
Biotynylowany ICAM1			Informacje na temat fałdowania białek znajdują się w odniesieniu w protokole. Do biotynylacji użyj zestawu BirA
Ręczna lampa UV	Promieniowanie UVP	UVGL-25	Lampę trzyma się < odległości 1 cm od próbki. 30 s światła 365 wystarcza do wykrywalnego decytacji, 20 minut do ilościowego decytacji.
System Olympus IX-81 OMAC TIRF.	Olympus		Dodatkowe informacje na temat systemu obrazowania można znaleźć na rysunku 6
Membrana cyfrowa Mosaic	Andor
Oprogramowanie do tworzenia książeczek do slajdów	Innowacje w zakresie inteligentnego obrazowania