1. Przygotowanie ludzkich efektorów/komórek T pamięci CD4+ Th1
- Przyłóż opaskę uciskową do ramienia dawcy, przetrzyj żyłę alkoholem i wbij igłę. Powoli pobrać 15 ml krwi do urządzenia próżniowego, używając EDTA jako antykoagulantu. Po pobraniu krwi rozwiąż opaskę uciskową przed wyjęciem igły. Po wyjęciu igły natychmiast przyłożyć ucisk do rany sterylną gazą.
- Przenieść krew do probówki o pojemności 50 ml. Dodać RPMI-1640 w temperaturze pokojowej w rozcieńczeniu 1:1 (końcowa objętość 30 ml). Ostrożnie nałożyć rozcieńczoną krew na dwie probówki o pojemności 50 ml zawierające 15 ml wstępnie przefiltrowanego podłoża do izolacji limfocytów, takiego jak Ficoll-Paque w temperaturze pokojowej.
- Odwirować gradient w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy 1 200 x g w obracającym się wirniku kubełkowym. Podczas wirowania przygotuj pożywkę z limfocytów T (500 ml RPMI-1640, 50 ml FCS, 5 ml penicyliny/streptomycyny).
- Po wyjęciu probówki o pojemności 50 ml z wirówki należy obserwować cztery warstwy: osad czerwonych krwinek na dnie, paque, warstwę komórek zawierającą białe krwinki (w tym limfocyty) i osocze. Ostrożnie usunąć warstwę białych krwinek za pomocą pipety Pasteura i przenieść ją do 50 ml probówki Falcon.
- Przemyć warstwę białych krwinek, dodając RT RPMI-1460 (do 20 ml) i odwirowując w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 1,200 x g. Ponownie zawiesić białe krwinki w 1 ml pożywki z limfocytów T. Dodać 5 μl zawiesiny 1 ml komórek do 250 μl pożywki z limfocytów T w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i delikatnie mieszać pipetą w górę i w dół.
- Dodać 25 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek do 25 μl 0,4% błękitu trypanowego. Dodać 10 μl mieszaniny z każdej strony wzorcowego hemocytometru.
- Umieść hemocytometr na mikroskopie świetlnym małej mocy. Używając obiektywu 10X, policz liczbę żywych komórek, które wykluczyły niebieski barwnik trypanowy i są obecne w środkowym kwadracie po obu stronach hemocytometru.
- Aby obliczyć stężenie komórek, pomnóż średnią z 2 kwadratów przez 100 (współczynnik rozcieńczenia), a następnie pomnóż przez 104, aby uzyskać liczbę komórek/ml.
- Dostosuj końcowe stężenie do 0,5 x 106 komórek/ml w pożywce z komórek T. Dodać do komórek końcowe stężenie 1 μg/ml superantygenów bakteryjnych, enterotoksyny gronkowcowej B (SEB) i toksyny zespołu wstrząsu toksycznego 1 (TSST) do komórek. Hodowla przez 72 godziny (37 °C i 5% CO2 ) w celu rozszerzenia populacji limfocytów T CD4 +.
- Limfocyty T w osadach (1 200 x g, 5 min) i ponownie zawiesić w stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml w pożywce z limfocytów T z dodatkiem ludzkiej IL-15 (20 ng / ml). Przenieść limfocyty do kolby T150. Kontynuuj rozwijanie/dzielenie komórek w pełnym podłożu-IL-15 co 24-48 godzin w razie potrzeby (w zależności od koloru podłoża; tj. za każdym razem, gdy nośnik zmieni kolor z różowego na lekko żółty). Utrzymuj powstałą populację limfocytów przez okres do 15 dni.
nuta: Z założenia protokół ten aktywuje i rozszerza w szczególności podzbiór limfocytów T CD4 +, które są reaktywne na SEB i TSST, a następnie kieruje je w kierunku fenotypu efektorowego / pamięciowego podobnego do Th1. Inne białe krwinki nie są w stanie przetrwać i rosnąć w tych warunkach, tak że w kroku 1.10 komórki będą składać się w co najmniej 95% z limfocytów T CD4 +, CD45RO +, co można łatwo ocenić za pomocą cytometrii przepływowej. W razie potrzeby dalsze oczyszczanie można łatwo osiągnąć za pomocą dostępnych na rynku zestawów do selekcji dodatniej lub ujemnej na bazie przeciwciał/kulek magnetycznych.
2. Rozpoczęcie hodowli pierwotnych komórek śródbłonka ludzkiego
- Pokryć kolbę T25 fibronektyną (FN) 20 μg/ml w PBS w sterylnych warunkach. Pozostaw w RT na 30-60 min. Usunąć FN i dodać 5 ml kompletnego podłoża (pożywki Endothelial Basal Medium (EBM-2) uzupełnionej pojedynczymi kwotami Endothelial Growth Medium (EGM-2)). Wstępną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
- Rozmrozić fiolkę z zamrożonymi ludzkimi komórkami śródbłonka płuc lub skórnymi mikrokrążeniami płuc (HLMVEC lub HDMVECs) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, od czasu do czasu delikatnie mieszając przez ~2-3 min. Natychmiast przenieść komórki do kolby T25 zawierającej wstępnie ogrzaną pożywkę. Delikatnie zamieszać i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
- Zmień nośnik po ~4-6 godzinach. Kontynuuj wymianę nośnika mniej więcej co 48 godzin (lub gdy nośnik stanie się lekko żółty), aż płytka osiągnie ~90-95% zbieżności.
3. Ogólne rozszczepianie i rozszerzanie komórek śródbłonka
- Hoduj komórki do ~90-95 zbiegów. Może to potrwać od 2 do 5 dni. W celu rozszczepienia wyjmij podłoże i spłucz PBS. Usuń PBS i zastąp minimalną objętością świeżej 1x trypsyny (0,5 ml dla T25 lub 1,5 ml dla T75). Delikatnie zamieszaj, aby pokryć wszystkie powierzchnie trypsyną. Inkubować w temperaturze 37 °C przez ~5 min. Monitoruj oderwanie komórek od płytki za pomocą mikroskopu świetlnego o małej mocy.
- Gdy większość komórek wydaje się zaokrąglona lub oderwana, dodać 5 objętości (tj. w porównaniu z dodaną objętością trypsyny) wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki EGM-2 i delikatnie pipetować powierzchnię kolby, aby odłączyć wszystkie komórki.
- Policz komórki śródbłonka za pomocą hemocytometru, jak opisano w 1.6-1.7. Granulować komórki przez odwirowanie (5 min, 1 200 x g). Usunąć supernatant. Dostosuj stężenie do 0,5 miliona komórek na ml przez dodanie wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki EGM-2 MV.
- Przenieść porcje komórek do odpowiednich szalek lub kolb pokrytych FN w celu konserwacji. Delikatnie zakręć i umieść w inkubatorze. Zmień nośnik w ciągu 6-12 godzin od poszycia. Następnie media należy wymieniać mniej więcej co 48 godzin.
4. Transfekcja komórek śródbłonka
UWAGA: Pierwotne komórki śródbłonka są oporne na transfekcję za pomocą najpowszechniejszych metod chemicznych i elektroporacji. Opisana poniżej metoda oparta na transfekcji jądrowej pozwala na uzyskanie stosunkowo wysokiej wydajności transfekcji (~50-70%). Skuteczną metodą alternatywną jest wykorzystanie infekcji odpowiednimi wektorami wirusowymi (patrz uwagi w Tabeli materiałów).
- Przygotować kolby T25 lub T75 (w zależności od potrzeb) HLMVEC lub HDMVEC do końcowej gęstości 90-95% zgrywania. Pokryć fibronektyną (FN) 20 ug/ml w PBS w sterylnych warunkach na płytkach do hodowli mikroskopowej, takich jak płytki Delta-T (dla kroku 5) lub 12 mm okrągłych szklanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (dla kroku 6) w sposób opisany powyżej (2.1).
- Dodać 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej EGM-2 do mikroskopowych płytek hodowlanych lub 0,5 ml do każdej z 24 studzienek i wyrównać płytki w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .
- Pobrać i policzyć komórki śródbłonka jak w krokach 3.1-3.3. Odwirować wymaganą objętość komórek (0,5 miliona komórek na próbkę) przy 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zawiesić osad komórkowy w 100 μl roztworu do transfekcji jądrowej RT na próbkę.
- Połącz 100 μl zawiesiny komórkowej z 1-5 μg DNA. Przenieś zawiesinę komórki/DNA do certyfikowanej kuwety; Próbka musi pokrywać dno kuwety bez pęcherzyków powietrza.
UWAGA: Konstrukty ukierunkowane na YFP lub DsRed do błony komórkowej (poprzez N-końcowe 20 aminokwasów neuromoduliny, która zawiera sygnał do potranslacyjnej palmitoilacji) stosowano samodzielnie (sama błona-YFP lub sama membrana-DsRed) lub współtransfekowane z cytoplazmatycznym markerem wolumetrycznym (np. błona-YFP i rozpuszczalny DsRed). Można zastosować wiele permutacji fluorescencyjnych markerów białkowych.
- Zamknij kuwetę nakrętką. Włóż kuwetę z zawiesiną komórki/DNA do uchwytu kuwety elektroporatora i zastosuj program do elektroporacji S-005. Wyjmij kuwetę z uchwytu po zakończeniu programu.
- Dodaj ~ 500 μl wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej do kuwety i delikatnie usuń zawiesinę komórek z kuwety za pomocą plastikowych pipet transferowych dostarczonych w zestawie do transfekcji jądrowej.
- W przypadku eksperymentów z użyciem mikroskopu na płytkach hodowlanych należy równo podzielić zawiesinę komórek z jednej reakcji między dwie szalki zawierające wstępnie podgrzane pożywki (kroki 4.2-4.3). W przypadku eksperymentów z użyciem 24 dołków/płytek, należy równo podzielić jedną reakcję między 3 dołki.
- Inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 i zmieniać pożywkę przez 4-6 godzin, a następnie ponownie po 12-16 godzinach po transfekcji.
5. Obrazowanie i analiza żywych komórek
- Przygotowanie śródbłonka
- Dzień 0: Kotransfekcja pierwotnych HLMVEC z błoną YFP i rozpuszczalnym DsRed za pomocą technologii nukleofekcji, jak opisano w kroku 4, i umieszczenie na płytkach do obrazowania żywych komórek.
- Dzień 1: Zastąp pożywkę świeżą pożywką zawierającą IFN-γ (100 ng/ml) w celu wywołania ekspresji MHC-II. W dniu 2. Stymulować transfekowane komórki przez dodanie 20 ng/ml TNF-α do istniejących pożywek.
- W dniu 3 inkubować śródbłonek z 1 μg/ml każdego z superantygenów bakteryjnych: enterotoksyny gronkowcowej B (SEB) i toksyny zespołu wstrząsu toksycznego 1 (TSST) w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut bezpośrednio przed eksperymentami. Pomiń ten krok dla warunków kontrolnych '-Ag'
.
- Przygotowanie limfocytów
- Równolegle z krokiem 5.1.3 należy przygotować bufor A (HBSS wolny od czerwieni fenolowej) uzupełniony 20 mM HEPES, pH 7,4 i 0,5% v/v albuminy surowicy ludzkiej wstępnie podgrzanej do 37 °C. Pobrać próbkę hodowanych limfocytów i określić gęstość, licząc za pomocą hemocytometru (krok 1.12-1.17).
- Odwirować 2 miliony komórek na próbkę przy 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odessać pożywkę i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu A, tak aby nie pozostały żadne skupiska komórek.
- Usunąć świeżą porcję barwnika wapniowego Fura-2 i ponownie zawiesić w DMSO, aby uzyskać stężenie wyjściowe 1 mM.
- Dodać 2 μl roztworu podstawowego Fura-2 do zawiesiny limfocytów T (stężenie końcowe 2 μM), zakryć probówkę i natychmiast wymieszać, odwracając probówkę, aby zapewnić równomierne rozproszenie barwnika. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Odwirować jak w kroku 5.2.2. Odessać Buffer-A i delikatnie, ale dokładnie zawiesić limfocyty w 20-40 μl świeżego Buffer-A.
- Konfiguracja i akwizycja obrazowania żywych komórek
UWAGA: Do obrazowania fluorescencji żywych komórek w mikroskopach ze światłem pionowym i odwróconym można zastosować szeroką gamę systemów. Podstawowe wymagania obejmują fluorescencyjne źródło światła i filtry, kamerę CCD, zmotoryzowane przełączanie filtrów i żaluzje, podgrzewany stolik (lub podgrzewaną komorę montowaną w mikroskopie) oraz oprogramowanie do automatycznej akwizycji obrazu. W przypadku tego protokołu wymagane są soczewki immersyjne z olejkiem o dużej aperturze numerycznej i dużym powiększeniu (tj. 40X, 63X), aby osiągnąć niezbędną rozdzielczość przestrzenną. Należy zachować szczególną ostrożność przy wyborze odpowiedniego źródła fluorescencji i soczewek do obrazowania wapnia na bazie Fura-2, ponieważ nie wszystkie są zgodne z wymaganymi długościami fal wzbudzenia 340/380 nm. Alternatywne podejście (kompatybilne ze standardowymi zestawami filtrów zielonej i czerwonej fluorescencji) można zastosować w przypadku nieratiometrycznych barwników wrażliwych na wapń (np. Fluo-4, Rhod-3), chociaż nie mogą one dokładnie określić ilościowo strumienia wapnia i zapewniają jedynie względny/ilościowy odczyt.
- Włącz system mikroskopu (komputer do obsługi, mikroskop, kamera CCD, koło filtrów i lampa ksenonowa).
- Otwórz wyznaczone oprogramowanie.
- Skonfiguruj mikroskop/oprogramowanie do automatycznego wielokanałowego obrazowania poklatkowego. Obejmują sekwencyjną akwizycję różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), standardowej zielonej fluorescencji, standardowej czerwonej fluorescencji oraz standardowych obrazów Fura-2 wzbudzenia 340 i 380 nm. Ustaw interwał akwizycji na 10-30 sekund i łączny czas trwania ~20-60 minut.
- Ustaw czasy naświetlania dla obrazowania Fura-2.
- Dodaj świeży olej do obiektywów i zamontuj naczynie mikroskopowe zawierające tylko 0,5 ml buforu-A na podgrzewaniu stage adapter i natychmiast włącz, aby zrównoważyć do 37 °C (zajmie to ~ 2-3 min).
- Dodać spoczynkowe limfocyty obciążone Fura2 do zamontowanej komory czaszy mikroskopu za pomocą pipety o pojemności 20 μl.
- Włącz obrazowanie w jasnym polu. Wybierz drogę światła do okularów. Użyj pokrętła zgrubnej ostrości, aby zetknąć obiektyw z dnem czaszy mikroskopu. Użyj okularu i precyzyjnego pokrętła ostrości, aby ustawić ostrość na limfocytach T osadzonych na dnie naczynia.
- Użyj kontrolek stołu montażowego x-y, aby zaznaczyć pole zawierające co najmniej 10 komórek. Unikaj nadmiernie zatłoczonych pól i zagęszczeń komórek, ponieważ będą one tworzyć artefakty obrazowania.
- Przełącz się z jasnego pola na fluorescencyjne źródło światła. Przełącz się z obrazowania okularu na kamerę CCD. Ustaw parametry akwizycji (np. czas ekspozycji, wzmocnienie detektora i binning). Za pomocą oprogramowania można uzyskać spoczynkowe obrazy Fura2-340 i Fura2-380 (zaczynając od identycznego czasu naświetlania dla każdego z nich, zwykle w zakresie ~200-1,000 ms).
- Użyj metod opisanych w kroku 5.4.1, aby obliczyć Fura2-340/Fura2-380 dla każdego limfocytu. Wykonuj wielokrotne iteracje dostosowywania czasów ekspozycji Fura2-340 i Fura2-380, uzyskiwania obrazów i obliczania współczynników, aż średnie wartości zbliżą się do 1.
- Ustaw czasy ekspozycji dla mem-YFP i DsRed.
- Zastąp czaszę mikroskopu użytą w kroku 5.3.3.1 czaszą mikroskopową zawierającą transfekowane, aktywowane i poddane działaniu SAg (lub niepoddane działaniu SAg; kontrola) HLMVEC lub HDMVEC z inkubatora do hodowli komórkowych (kroki 4.5.1). Użyj jednorazowej pipety transferowej, aby szybko usunąć pożywkę, przepłukać jeden raz dodatek ~1 ml wstępnie podgrzanego buforu-A. Odessać, a następnie dodać 0,5 ml buforu A.
- Zidentyfikuj pola, w których obecne są jaskrawo fluorescencyjne dodatnie transfektanckie komórki śródbłonka i wydają się zdrowe z dobrze uformowanymi połączeniami międzykomórkowymi.
- Dostosuj parametry akwizycji (np. czas ekspozycji, wzmocnienie detektora i binning) dla mem-YFP i DsRed. Upewnij się, że średnie natężenie sygnału fluorescencji w każdym kanale mieści się w przedziale od 25% do 75% zakresu dynamiki detektora.
- Przeprowadzanie eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek.
- Użyj zautomatyzowanego oprogramowania, aby rozpocząć akwizycję obrazu i przechwycić kilka interwałów obrazów w celu ustalenia linii bazowej.
- Podczas akwizycji nałóż ~ 5 μl skoncentrowanych limfocytów obciążonych Fura-2 (z kroku 5.2) do środka pola obrazowania czaszy mikroskopu, wkładając końcówkę pipety o małej objętości (P-5 lub P-20) do pożywki w pobliżu środka obiektywu i powoli wyrzucając.
- Gdy limfocyty osiadają w polu obrazowania, dokonaj precyzyjnych regulacji ostrości, aby zapewnić utrzymanie interfejsu limfocytów T - komórek śródbłonka (synapsy immunologiczne) w płaszczyźnie ogniskowej. W przypadku obiektywów 40 i 63X optymalna jest ~10-20 komórek na pole. Jeśli w polu obrazowania zaobserwuje się mniejszą liczbę komórek, powtórz krok 5.3.4.2.
- Po upływie żądanego okresu obserwacji w eksperymencie, należy kontynuować obrazowanie i natychmiast pipetować jonomycynę bezpośrednio do czaszy mikroskopu (stosując technikę jak w ppkt 5.3.4.2) do końcowego stężenia 2 μM w celu wywołania maksymalnego strumienia wapnia/sygnału sygnalizacyjnego Fura-2 (tj. sposób kalibracji, patrz analiza 5.4.).
