$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Transgeniczny mysi model rozwoju raka piersi
- Przed kontynuowaniem obserwuj myszy z pożądanego modelu raka pod kątem odpowiedniego wzrostu guza za pomocą badania palpacyjnego lub pomiaru suwmiarką.
nuta: W tym przypadku wykorzystano transgeniczny mysi model rozwoju raka piersi (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). U tych zwierząt spontanicznie rozwijają się inwazyjne raki piersi między 6 a 12 tygodniem życia w każdym gruczole sutkowym. Normalne gruczoły sutkowe wykorzystano jako kontrolę od transgenicznie ujemnych, dopasowanych wiekowo rodzeństwa z miotu.
2. Dożylne wstrzyknięcie specyficznych i niespecyficznych przeciwciał
- Oczyść królicze przeciwciała kontrolne przeciw myszemu B7-H3 i immunoglobulinie królika G (IgG) na kolumnie odsalającej (np. PD-10) w celu usunięcia konserwantów i do przechowywania zgodnie z instrukcjami producenta.
nuta: Niektóre przeciwciała mogą wymagać dalszego oczyszczania za pomocą protokołu opartego na kulkach agarozowych Protein-A.
- Podwielokrotne dawki 33 μg każdego koniugatu przeciwciała w poszczególnych probówkach do mikrowirówek.
nuta: Dawkowanie podawanego środka może się różnić w zależności od zastosowania i odpowiada dawkom, w których koniugat przeciwciała jest rutynowo stosowany. Stężenie roztworów przeciwciał jest wymagane, jeśli objętość jest większa niż 100 μl ze względu na bezpieczeństwo zwierząt.
- W pożądanym punkcie czasowym przed pobraniem tkanki, tutaj 96 godzin, znieczulić zwierzę z nowotworem za pomocą 2% izofluranu przepływającego w tlenu z prędkością 2 l/min i umieścić na podgrzanym etapie o temperaturze 37 °C. Uszczypnij palec u nogi, aby upewnić się, że przed zabiegiem osiągnięto odpowiedni poziom znieczulenia.
- Aby przygotować się do inokulacji roztworów przeciwciał do żyły ogonowej, należy zdezynfekować ogon zwierzęcia, przecierając go trzykrotnie wacikiem nasączonym alkoholem. Rozszerz żyły ogonowe, ogrzewając je poduszką rozgrzewającą przez około 30 sekund. Unikaj podgrzewania całego zwierzęcia. Przetrzyj ogon jeszcze raz chusteczką nasączoną alkoholem po wyjęciu poduszki grzewczej.
- Za pomocą cewnika do żył ogonowych 27G włóż igłę motylkową do jednej z dwóch bocznych żył ogonowych i ostrożnie przymocuj ogon z włożoną igłą do etapu za pomocą kawałka taśmy chirurgicznej.
nuta: Widoczny przepływ wsteczny krwi do cewnika wskazuje na prawidłowe umiejscowienie igły w żyle ogonowej.
- Przepłukać cewnik 25 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie wstrzyknąć roztwór przeciwciała do cewnika za pomocą strzykawek insulinowych. Ponownie przepłukać cewnik 25 μl sterylnego PBS.
- Wyjmij igłę z ogona i uciskaj, aby zatrzymać krwawienie.
- Wyłącz znieczulenie i obserwuj zwierzę, aż do całkowitego wybudzenia się nie pojawi się w poszukiwaniu jakichkolwiek oznak niepokoju.
3. Pobieranie i przygotowanie docelowych tkanek nowotworowych
- W pożądanym momencie humanitarnie poddać zwierzę eutanazji zgodnie z akceptowalną procedurą instytucjonalną, w tym przypadku poprzez stopniowe wdychanie 100% CO2 ze zbiornika sprężonego gazu o natężeniu przepływu w komorze 10-30% objętości / min.
nuta: Niektóre zastosowania techniki IVIL wymagają eutanazji przez perfuzję serca z PBS w celu usunięcia swobodnie krążących przeciwciał.
- Po potwierdzeniu humanitarnej eutanazji poprzez zaprzestanie ruchów oddechowych i sercowych, brak reakcji na szczypanie palców u nóg i szarzenie błon śluzowych, należy wyciąć tkanki nowotworowe za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy w następujący sposób:
- Połóż mysz w pozycji leżącej na plecach i chwytając kleszczami tylko zewnętrzną warstwę skóry między zestawem gruczołów sutkowych najbliżej ogona (5.), wykonaj małe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi.
- Wprowadź zamknięte nożyczki do nacięcia i powoli otwórz końcówkę, aby ostrożnie oddzielić skórę od leżącej pod spodem błony ściany brzucha, utrzymując ją nienaruszoną.
- Wykonaj pionowe nacięcie w górę brzucha, kontynuując oddzielanie skóry od błony wewnętrznej. Pomiędzy 3. a 4. gruczołem sutkowym wykonaj poziome cięcie w poprzek brzucha, aby umożliwić cofnięcie skóry i wizualizację gruczołów sutkowych.
nuta: Guzy i gruczoły sutka znajdują się powierzchownie pod skórą.
- Chwytając każdy guz lub normalny gruczoł kleszczami, ostrożnie odetnij przyczepioną skórę za pomocą nożyczek chirurgicznych.
- Umieść wycięte tkanki w jednorazowych foremkach do tkanek, wstępnie oznaczonych i wypełnionych podłożem do zatapiania w optymalnej temperaturze cięcia (OCT), a następnie szybko zamroź formy, umieszczając je na suchym lodzie. W celu zbadania podawania poza celem należy wyciąć inne tkanki lub narządy będące przedmiotem zainteresowania (np. wątrobę lub płuca).
nuta: Aby wstrzymać protokół w tym momencie, przechowuj zamrożone bloki tkanek w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kontynuowania.
- Za pomocą kriostatu należy pokroić zamrożone bloki tkanek o grubości 10 μm i umieścić sąsiednie skrawki na wstępnie oznakowanych szkiełkach adhezyjnych.
nuta: Aby wstrzymać protokół w tym momencie, przechowuj szkiełka w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kontynuowania.
4. Protokół barwienia ex vivo
UWAGA: Dla ilościowego porównania obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej, wszystkie preparaty są barwione w tym samym czasie tymi samymi przygotowanymi roztworami.
- Płukać zamrożone szkiełka tkankowe PBS o temperaturze pokojowej przez 5 minut w celu usunięcia OCT.
- Odgranicz skrawki tkanek za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, aby zmniejszyć objętość roztworów potrzebnych podczas barwienia.
nuta: Należy uważać, aby wstrzykiwacz nie przesuwał się po próbkach tkanek, ponieważ może to spowodować usunięcie tkanki z szkiełka lub uniemożliwić prawidłowe zabarwienie zmienionej chorobowo części tkanki. Nie pozwól, aby skrawki tkanki uległy odwodnieniu w żadnym momencie.
- Utrwalić skrawki tkanki 4% roztworem paraformaldehydu na 5 minut.
- Płukać szkiełka w PBS przez 5 minut.
- Przepuszczalność skrawków tkanek 0,5% Triton-X 100 w PBS przez 15 min.
- Płukać szkiełka w PBS przez 5 minut.
- Zablokuj tkanki 3% w/v albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5% v/v surowicy koziej, obie w PBS (roztwór blokujący) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
nuta: Dopasuj surowicę roztworu blokującego do drugorzędowego przeciwciała zwierzęcia gospodarza.
- Płukać szkiełka w PBS przez 5 minut.
- W razie potrzeby inkubować sekcje z pierwszorzędowymi przeciwciałami prowadzącymi rejestrację, ewentualnie powszechnym markerem jądrowym (np. DAPI), naczyniowym (np. CD31) lub cytoplazmatycznym (np. Aktyna). W tym przypadku zastosowano szczurzy CD31 (marker naczyniowy) w rozcieńczeniu 1:100 zgodnie z instrukcjami producenta w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C, chronionym przed odwodnieniem na szkiełkowej tacy.
nuta: Nie należy dodawać dodatkowych przeciwciał pierwszorzędowych ani koniugatów przeciwciał. Koniugat, który został wstrzyknięty i pozostawiono do akumulacji w tkankach in vivo, działa jako przeciwciało pierwszorzędowe.
- Płukać szkiełka w PBS przez 5 minut trzy razy, za każdym razem zmieniając PBS.
- Inkubować szkiełka z przeciwciałami drugorzędowymi w celu oznaczenia przeciwciał pierwszorzędowych. W tym zastosowaniu należy uwidocznić przeciwciało anty-B7-H3 za pomocą sprzężonego koziego przeciwciała anty-króliczego AlexaFluor-546 (rozcieńczenie 1:200, zoptymalizowane zgodnie z instrukcjami producenta) i CD31 z kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko szczurom AlexaFluor-488 (rozcieńczenie 1:200, zoptymalizowane zgodnie z instrukcjami producenta) w roztworze blokującym, chronionym przed światłem i odwodnieniem na szkiełkowej tacy, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
nuta: Przeciwciała drugorzędowe pochodzą od tego samego zwierzęcia gospodarza, ale odpowiadają powinowactwu przeciwciał drugorzędowych do gatunku gospodarza odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego. Od tego momentu zjeżdżalnie są chronione przed światłem.
- Płukać szkiełka w PBS przez 5 minut trzy razy, za każdym razem zmieniając PBS.
- Nałóż jedną kroplę podłoża mocującego na środek wycinka chusteczki i ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza.
- Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia.
nuta: Aby wstrzymać protokół na okres do tygodnia w tym momencie, przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do kontynuowania.
5. Obrazowanie mikroskopem konfokalnym i ilościowa analiza obrazu
UWAGA: Przygotowanie mikroskopu konfokalnego i parametry obrazowania będą zależały od użytego systemu konfokalnego. Zastosowany tutaj mikroskop został zakupiony na rynku (np. system Zeiss LSM 510 Meta) i wykorzystano związane z nim oprogramowanie do akwizycji (np. Zen 2009). Jednak wiele z tych kroków będzie miało zastosowanie do każdego mikroskopu konfokalnego i zakłada podstawową wiedzę z zakresu mikroskopii konfokalnej.
- Po włączeniu i rozgrzaniu systemu wybierz żądany obiektyw; w tym przypadku użyto obiektywu 20x (przysłona numeryczna = 0,8).
- Załaduj suwak kontroli dodatniej, szkiełko nakrywkowe w dół, aby umożliwić ustawienie optymalizacji dla najjaśniejszego sygnału. Obrazowanie w kanale czerwonym, ustaw ostrość systemu na próbce w trybie obrazowania na żywo.
- Dla każdego używanego kanału laserowego zoptymalizuj intensywność lasera, wzmocnienie główne i rozmiar otworu w następujący sposób:
- Przełącz na tryb ciągły do obrazowania.
- Zoptymalizuj suwaki intensywności lasera (która kontroluje moc lasera) i wzmocnienia (Master) (która kontroluje napięcie lampy fotopowielacza), jednocześnie monitorując histogram tabeli przeglądowej (LUT). Dostosuj te dwa ustawienia, aż zakres dynamiczny histogramu zostanie wypełniony bez nasycania pikseli.
nuta: Jeśli intensywność lasera jest zbyt wysoka, nastąpi fotowybielanie. Jeśli wzmocnienie (Master) jest zbyt wysokie, obraz stanie się zaszumiony. Idealnie byłoby, gdyby Gain (Master) znajdował się w środku swojego zakresu.
- Ustaw otwór na 1 jednostkę przewiewną (AU), co daje najwyższą rozdzielczość i najcieńszy plasterek Z.
- Przesuń pasek przesunięcia cyfrowego, aby zminimalizować poziom szumów na histogramie LUT, aby uzyskać prawdziwe czarne tło.
nuta: Po zoptymalizowaniu ustawień mikroskopu dla każdego kanału lasera i obiektywu, utrzymuj je na stałym poziomie przez całą sesję obrazowania i podczas obrazowania wszystkich preparatów, aby umożliwić ilościowe porównanie między szkiełkami.
- Na karcie Tryb akwizycji, w obszarze Uśrednianie, wybierz żądaną liczbę i głębię bitową. Kliknij przycisk Optymalny, aby ustawić optymalny rozmiar w pikselach.
- Użyj przycisku Przyciąganie do akwizycji, aby zebrać obraz wysokiej jakości. W tym przypadku losowe pola widzenia zostały wybrane z wnętrza guza, ale inne obszary zainteresowania mogą mieć zastosowanie do różnych zastosowań (naczynia, brzegi guza, głębokość penetracji itp.)
- Zapisz pliki obrazów w formacie używanym przez oprogramowanie konfokalne (tutaj ".lsm") do przetwarzania i kwantyfikacji w trybie offline.
nuta: Jeśli nie wszystkie slajdy zostaną zobrazowane podczas tej samej sesji, zapisz ustawienia i załaduj je ponownie podczas kolejnych wizyt, chociaż ponowne obrazowanie tego samego slajdu nie jest zalecane ze względu na fotowybielanie.
- Wykonaj ilościowe pomiary intensywności fluorescencji. Otwórz Fidżi (Fidżi to tylko oprogramowanie ImageJ) i załaduj plik obrazu .lsm, przeciągając go na pasek stanu.
- Podziel dane kanału koloru. Przejdź do Stosy obrazów > > Podziel kanały.
- W razie potrzeby wstępnie przetwórz obrazy fluorescencyjne, tj. odejmij sygnał tła (Przetwarzaj > odejmij tło) lub zmniejsz szum za pomocą metody filtrowania.
- Podziel kanał koloru odpowiadający białku referencyjnemu (barwienie naczyniowe, jądrowe, komórkowe), ustawiając próg intensywności sygnału (Obraz > Dostosuj próg >).
nuta: Ręczne progowanie wprowadza subiektywność do analizy obrazu, dlatego użycie automatycznego algorytmu progowania lub odniesienie do histogramów obrazu sprawia, że wyniki analizy obrazu są mniej stronnicze.
- Użyj tego progu, aby utworzyć maskę binarną (Process > Binary > Convert to Mask (Przetwarzaj Konwertuj na maskę).
- Zmierz i oznacz zwrot z inwestycji w masce (Analizuj > Analizuj cząstki > Zaznacz opcję Dodaj do Menedżera > OK).
- Zastosuj zwrot z inwestycji do kanału koloru odpowiadającego interesującemu Cię przeciwciału (obraz kanału kliknięcia, narzędzia do analizy > > Menedżer zwrotu z inwestycji > pomiar). Spowoduje to zastosowanie zwrotu z inwestycji maski do obrazu przeciwciała i zapewnienie pomiarów obrazu dla sekcji etykiety w oknie Wyniki. Okno Zapisz wyniki (Plik > Zapisz).
- Oblicz żądaną statystykę, która Cię interesuje, taką jak średnia intensywność fluorescencji, jak opisano tutaj.
- Wykonaj wszystkie kroki przetwarzania identycznie jak każdy obraz w zestawie slajdów. Utwórz makro, aby zrobić to automatycznie dla dużych partii obrazów.
- W przypadku wyświetlania obrazu tylko po pomiarach ilościowych należy zastosować jakościowe korekty obrazu, aby zoptymalizować wizualizację wzorców biodystrybucji, dostosowując minimum, maksimum, jasność i kontrast do tych samych poziomów na wszystkich slajdach (Image > Adjust > Brightness/Contrast).
- Przekonwertuj typ obrazu (Typ obrazu > > Kolor RGB) i zapisz pliki w bezstratnym typie obrazu, takim jak .tiff (File > Save As > Tiff...) do wykorzystania w prezentacjach i publikacjach.