Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do identyfikacji przeciwciał specyficznych dla patogenu w ślinie

Abstract

Źródło: Augustine, S. A. J., et al. Opracowanie multipleksowego testu immunologicznego przeciwciał ślinowych do pomiaru narażenia człowieka na patogeny środowiskowe. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje technikę multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie wykrywa przeciwciała przeciwko wielu patogenom środowiskowym w ludzkiej ślinie. Kulki fluorescencyjne sprzężono z antygenami różnych patogenów, które wychwycono za pomocą przeciwciał w próbce ludzkiej śliny. Po znakowaniu przeciwciał za pomocą reportera fluorescencyjnego, kulki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny obecności w ślinie różnych przeciwciał specyficznych dla patogenu.

Protocol

1. Łącznik koralików

1. Sprzęgnąć antygeny z zestawami kulek, stosując stężenia pokazane w tabeli 1.
2. Dodaj każdy antygen do aktywowanych kulek i doprowadź całkowitą objętość do 500 μl w 50 mM MES, pH 5,0. Wymieszaj antygeny i kulki za pomocą wiru.
3. Inkubować antygeny i kulki przez 2 godziny z mieszaniem przez rotację (~15 obr./min) w temperaturze pokojowej w ciemności. Sprzężone kulki osadzać przez mikrowirowanie przy 10 000 x g przez 2 minuty.
4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 500 μl buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS)-albuminy surowicy bydlęcej (BSA)-monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (Tween-20)-azydku sodu (PBS-TBN) o pH 7,4 poprzez wirowanie i sonikację. Granulki osadzać przez mikrowirowanie przy 10 000 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant.
   ostrożność: Azydek sodu jest bardzo toksyczną substancją chemiczną. Jest śmiertelny w przypadku połknięcia lub kontaktu ze skórą. Nie wdychać pyłu/oparów/gazów/mgły/par ani rozpylonej cieczy. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas obchodzenia się z nim i utylizacji zgodnie z odpowiednimi przepisami.
5. Zawiesić kulki w 1 ml PBS-TBN za pomocą wiru i sonikacji na 20 sekund.
6. Granulki granulować przez mikrowirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 2 minuty.
7. Powtórz kroki 1.5 i 1.6.
   nuta: Zapewnia to w sumie dwa prania z PBS-TBN.
8. Ponownie zawiesić sprzężone i umyte kulki w 1 ml PBS, 1% BSA, 0,05% Azide, pH 7,4. Przechowuj sprzężone koraliki w lodówce o temperaturze 2-8 °C w ciemności.

2. Test immunologiczny Multiplex w ślinie

1. Usuń ślinę z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozwól jej rozmrozić się w temperaturze pokojowej.
2. Ponownie zawiesić zapasy kulek sprzężonych z antygenem za pomocą wiru i sonikacji na 20 sekund.
3. Przygotować roboczą mieszaninę kulek, rozcieńczając sprzężone granulki do końcowego stężenia 100 kulek/μl każdego unikalnego zestawu kulek w buforze PBS-1% BSA.
4. Przygotować rozcieńczenie śliny w stosunku 1:4 z buforem PBS-1% BSA w 96-dołkowej płytce z głębokim dołkiem.
5. Wstępnie zwilżyć płytę filtracyjną 100 μl buforu płuczącego i usunąć supernatant za pomocą podciśnienia.
6. Dodać 50 μl mieszaniny kulek roboczych i równą objętość rozcieńczonej śliny do 95 dołków 96-dołkowych płytek filtracyjnych w celu końcowego rozcieńczenia 1:8. Wymieszać reakcje za pomocą pipetora wielokanałowego. Do jednej studzienki kontrolnej dodaj 50 μl kulek sprzężonych z antygenem oraz 50 μl buforu BSA PBS-1% (jako zamiennik śliny).
7. Przykryć i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 500 obr./min. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.
8. Zawiesić kulki w 50 μl PBS-1% BSA za pomocą pipetora wielokanałowego.
9. Rozcieńczyć biotynylowane kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG o wtórnym wykrywaniu do 16 μg/ml w PBS-1% BSA.
10. Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki i wymieszać zawartość za pomocą pipetora wielokanałowego.
11. Przykryj płytkę filtracyjną i pozostaw do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.
12. Zawiesić kulki w 50 μl PBS-1% BSA za pomocą pipetora wielokanałowego.
13. Rozcieńczyć reporter streptawidyny-R-fikoerytryny (SAPE) do 24 μg/ml w PBS-1% BSA.
14. Dodać 50 μl reportera do każdego dołka i wymieszać z pipettorem wielokanałowym.
15. Przykryj płytkę filtracyjną i pozostaw do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.
16. Zawiesić kulki w 100 μl PBS-1% BSA i przeanalizować 50 μl za pomocą analizatora.
    nuta: Wyniki multipleksowego testu immunologicznego są mierzone w jednostkach mediany intensywności fluorescencji (MFI). Zawsze odwołuj się do najnowszej wersji instrukcji oprogramowania, jeśli jest dostępna, aby uniknąć błędów.

Tabela 1: Robocza mieszanka kulek do multipleksowego testu immunologicznego.Po zakończeniu sprzęgania i potwierdzenia, przygotowano mieszankę wzorcową składającą się z każdego zestawu kulek, jak pokazano. Mieszankę wzorcową rozprowadzono między wszystkimi studzienkami w 96-dołkowej płytce. Wszystkie studzienki inkubowano ze śliną, z wyjątkiem jednej studzienki kontrolnej w tle, która zawierała tylko kulki i bufor PBS-1% BSA.

Rozdział osób osób szt. SZT. szt. osób Rozdział osób Rozdział szt. Rozdział osób szt. TGL osób

antygen	Zestaw koralików	Bufor sprzęgający	Stężenie Ag (μg)	# koralików w 1 rogu	# koralików/μl	Objętość dla 100 B/uL dla 4 ml (μl)
C. jejuni (C. jejuni)	8	MES 5.0	50	Rozdział 64	6 400	94 Rozdział 94
H. pylori (H. pylori)	33 Rozdział 33	MES 5.0	25	71 Rozdział 71	7 100	Rozdział 85
Wirusowe zapalenie wątroby typu A	42 Rozdział 42	MES 5.0	100	91	9 100	Rozdział 66
T. gondii	Rozdział 30	MES 5.0	25	Rozdział 85	8 500	71 Rozdział 71
Norowirus GII.4	55	MES 5.0	5	72 Rozdział 72	7 200	Rozdział 83
Norowirus GI.1	67	MES 5.0	5	Rozdział 63	6 300	95 Rozdział 95
Niesprzężony	Rozdział 80	MES 5.0		60	6 000	100
		Całkowita objętość koralików (μl)				Okręg wyborczy 594
		Całkowita wymagana objętość bufora (μl)				3 406

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprzęt i oprogramowanie
Mikrowirówka	Korporacja Thermo Electron	75002446	Służy do wirowania próbek
Mieszalnik wirowy	Firma VWR	Telefon G560	Służy do mieszania próbek
Sonikator (mini)	Fisher Naukowy	15-337-22	Służy do oddzielania koralików
Pipety P10, P20, P100, P1000, 8 kanałów.	Capp	rozmaity
Wieloekranowy kolektor próżniowy	Milipory	MSVMHTS00	Stosowany na etapach mycia w celu usunięcia supernatantu
Mikrowytrząsarka	Firma VWR	12620-926	Służy do mieszania kulek podczas inkubacji
Stojak na probówki (1.5 ml i 0.5 mL) (różne)	Firma VWR	Nr kat. 30128-346
Waga	Mettler lub inny		Służy do odmierzania odczynników do przemywania do wytwarzania
Mieszalnik próbek Dynabead	Invitrogen	Zobacz materiał 947-01	Używany podczas etapu inkubacji sprzęgającej
MatLab (czynnik chłodniczy R2014b)	Firma MathWorks, Inc.		Służy do analizy danych dotyczących odpowiedzi przeciwciał
Program Microsoft Excel 2014	Korporacja Microsoft		Służy do analizy danych dotyczących odpowiedzi przeciwciał
Analizator Luminex z oprogramowaniem xPonent 3.1	Korporacja Luminex	LX200-XPON3.1	Przyrząd i oprogramowanie używane do przeprowadzania testu
antygeny
GI.1 Wirus Norwalk : cząstka p	Xi Jiang (CCHMC)*	nie	* Szpital Dziecięcy w Cincinnati. Stężenie końcowe 5 μg.
GII.4 Norowirus VA387 : cząstka p	Xi Jiang (CCHMC)*	nie	* Szpital Dziecięcy w Cincinnati. Stężenie końcowe 5 μg.
Wirus zapalenia wątroby typu A: koncentrat II stopnia z hodowli komórkowej	Meridian Nauki Przyrodnicze	Numer katalogowy: 8505	Antygen sprzężony przy 100 μg
Helicobacter pylori : lizat	Meridian Nauki Przyrodnicze	Czynnik R14101	Antygen sprzężony z prędkością 25 μg
Toxoplasma gondii : rekombinowany p30 (SAG1)	Meridian Nauki Przyrodnicze	Czynnik R18426	Antygen sprzężony z prędkością 25 μg
Campylobacter jejuni : ciepło zabiło całe komórki	KPL (Polskie Biuro	50-92-93	Antygen sprzężony w stężeniu 50 μg
Przeciwciała pierwszorzędowe
Anty-Norowirus świnki morskiej	(CCHMC)*	nie	Służy do potwierdzania sprzężenia
Mysz przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu A IgG	Meridian Nauki Przyrodnicze	C65885M	Służy do potwierdzania sprzężenia
Mysz przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu A IgG	Meridian Nauki Przyrodnicze	C65885M	Służy do potwierdzania sprzężenia
BacTraceAffinity Oczyszczone przeciwciało przeciwko Helicobacter pylori	KPL (Polskie Biuro	01-93-94	Służy do potwierdzania sprzężenia
Kozia pAb do Toxoplasma gondii	Księga Abcam	AB23507	Służy do potwierdzania sprzężenia
BacTrace Goat gatunki anty-Campylobacter	KPL (Polskie Biuro	01-92-93	Służy do potwierdzania sprzężenia
Przeciwciała drugorzędowe
Biotyna-SP-sprzężona AffiniPure Donkey anty-kozia IgG (H+L)	Jackson	Nr kat. 705-065-149	Służy do potwierdzania sprzężenia
Biotynylowany królik anty-kozi IgG (H+L)	KPL (Polskie Biuro	16-13-06	Służy do potwierdzania sprzężenia
Biotynylowane kozie przeciwciała anty-mysie IgG (H+L)	KPL (Polskie Biuro	16-18-06	Służy do potwierdzania sprzężenia
Powinowactwo Oczyszczone przeciwciało Biotyna znakowana kozią anty-króliczą IgG (H + L)	KPL (Polskie Biuro	Rozdział 176-1506	Służy do potwierdzania sprzężenia
Powinowactwo Oczyszczone przeciwciało Biotyna znakowana kozią anty-ludzką IgG (γ)	KPL (Polskie Biuro	16-10-02	Używany do testu immunologicznego śliny
Materiały spawalnicze
1,5 ml probówki wirówkowe z kopolimeru	USA Naukowe	Nr kat. 1415-2500	Stosowany jako probówki do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania
Wkłady do końcówek do pipet 10 μl	BioVentures (Przedsięwzięcia Biologiczne)	5030050C
Wkłady do końcówek do pipet 200 μl	BioVentures (Przedsięwzięcia Biologiczne)	5030080C
Wkłady do końcówek do pipet 1000 μl	BioVentures (Przedsięwzięcia Biologiczne)	5130140C
Folia aluminiowa	Różni dostawcy		Używany Utrzymuj koraliki w ciemności podczas inkubacji
Płytki ze studniami głębinowymi	Firma VWR	40002-009	Służy do rozcieńczania próbek śliny
Wieloekranowe płyty filtracyjne	Milipory	MABVN1250	Służy do przeprowadzania testów
System pobierania śliny Oracol	Malvern Medical Developments Ograniczona		Służy do zbierania śliny
Odczynniki
Karboksylowane mikrosfery (kulki)	Korporacja Luminex	W zależności od zestawu ściegów	Antygeny są sprzężone z mikrosferami
EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-[3dimetyloaminopropylo]karbodimidu)	przebijać	77149 lub 22980	Używany do aktywacji koralików
Sulfo-NHS (N-hydroksysulfosukcynimid)	przebijać	Numer katalogowy: 24510	Używany do aktywacji koralików
Steptawidyna-R-fikoerytryna (1 mg / ml)	Sondy molekularne	S-866	Używany jako reporter
MES (kwas 2-[N-morfolino]etanosulfonowy)	Sigma	Zobacz materiał M-2933	Służy do sprzęgania
Tween-20 (monolaurynian polioksyetylenosorbitanu)	Sigma	Zobacz materiał P-9416	Używany w buforze do płukania w celu usunięcia niespecyficznego wiązania
białkowe
Bufor blokujący/magazynujący PBS-TBN (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% Azide, pH 7,4)**			Filtruj Sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4°C
PBS, pH 7,4	Sigma	Zobacz materiał P-3813	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl
Bsa	Sigma	A-7888	0,1% (w/v)
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	Sigma	Zobacz materiał P-9416	0,2% (v/v)
Azydek sodu (0,05% azydek)**	Sigma	Nr kat. S-8032	**Uwaga: Azydek sodu jest bardzo toksyczny. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Utylizować zgodnie z obowiązującymi przepisami.
MES/ Bufor sprzęgający (0,05 m MES, pH 5,0)
MES (kwas 2-[N-morfolino]etanosulfonowy)	Sigma	S-3139
5 N NaOH	rybak	Zobacz materiał SS256-500
Bufor do oznaczania (PBS, 1% BSA, pH 7,4)			Filtruj Sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7,4	Sigma	Zobacz materiał P-3688	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% BSA
Bufor aktywacyjny (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)			Filtruj Sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4°C
NaH2PO4 (Sodu fosforan, jednozasadowy bezwodny)	Sigma	S-3139	0,1 mln NaH2PO4
5 N NaOH	rybak	Zobacz materiał SS256-500
Bufor do przemywania (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)			Filtruj Sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4°C
PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4	Sigma	Zobacz materiał P-3563	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN