Test immunofluorescencyjny do charakterystyki i ilościowego oznaczania granulek stresu ssaków

Streszczenie

Źródło: Aulas, A. et al., Metody klasyfikacji ognisk cytoplazmatycznych jako granulek stresu ssaków.J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje test do charakteryzowania i ilościowego oznaczania granulek stresu u ssaków, które składają się z mRNA, białek wiążących RNA (RBP) i różnych innych białek.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Dodać autoklawowane szkiełka nakrywkowe do 12 dołków na płytce 24-dołkowej, jak pokazano na rysunku 1A; można to zrobić za pomocą sterylnej pipety Pasteura podłączonej do próżni, aby pobrać każde szkiełko nakrywkowe. Delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe z boku studzienki, aby uwolnić ssanie, pozwalając szkiełku nakrywkowemu wpaść do studzienki.
2. Płytka 1 x 10⁵ komórek kostniakomięsaka U-2 OS (U2OS) na studzienkę w końcowej objętości 500 μL pożywki. Przesuń płytkę z boku na bok oraz kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone.
3. Delikatnie dociśnij szkiełka nakrywkowe czystą końcówką P1000, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe znajduje się na dnie studzienki i że pod szkiełkiem nakrywkowym nie ma pęcherzyków.

2. Komórki stresujące

1. Następnego dnia należy przeprowadzić wzrokową kontrolę płytki, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozproszone i równomiernie zlewają się na szkiełku nakrywkowym, ponieważ różnice między próbkami mogą niekorzystnie wpłynąć na odtwarzalność wyników. Użyj obiektywu 10X w odwróconym mikroskopie do hodowli tkankowych.
2. Podgrzej pożywkę do 37 °C. Unikaj nakładania na ogniwa zimnych lub gorących mediów, ponieważ powodują one odpowiednio szok zimny lub szok cieplny.
3. Rozcieńczyć leki w podgrzanym podgrzanym podłożu. Dla każdego innego stężenia leku przygotuj 2 studzienki zawierające 500 μl pożywki. Przygotować dodatkowe 500 μl, aby zapobiec stratom podczas pipetowania. Podwielokrotność 4 probówek, z których każda zawiera 1,5 ml.
   1. Dla arsenianu sodu: do każdej studzienki zawierającej 500 μl dodać 1,5 μl 100 mM arsenianu sodu (stężenie końcowe: 100 μM) lub dodać 0,75 μl 100 mM arsenianu sodu (stężenie końcowe: 50 μM).
   2. Dla winorobbiny: do każdej studzienki zawierającej 500 μl dodać 22,5 μl 10 mM winorebbiny (stężenie końcowe: 150 μM) lub dodać 18,75 μl 10 mM winorelbiny (stężenie końcowe: 100 μM).
      nuta: Arsenian sodu jest dobrze scharakteryzowanym i powszechnie stosowanym induktorem granulek stresu i dlatego jest klasycznie stosowany jako kontrola pozytywna.
4. Wyjmij i wyrzuć media z dołków B1 - 4 i C1 - 4. Dodaj pożywkę z lekami i odczekaj 60 minut (Rysunek 1A).
   1. Dodać 500 μl pożywki ze 100 μM arsenianem sodu do studzienek B1 i B2. Dodać 500 μl pożywki z 50 μM arsenianem sodu do studzienek B3 i B4.
   2. Dodać 500 μl pożywki ze 150 μM winorealbiną do studzienek C1 i C2. Dodać 500 μl pożywki ze 125 μM winorelbiną do studzienek C3 i C4.
5. 30 minut przed utrwaleniem potraktować studzienki w kolumnie 2 5 μl cykloheksymidu (1 mg/ml zapasu), a studzienki w kolumnie 4 2 μl puromycyny (1,25 mg/ml bulionu). Delikatnie kołysz płytką, aby wymieszać przed ponownym umieszczeniem płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

3. Utrwalanie komórek i immunofluorescencja

UWAGA: Przed eksperymentem upewnij się, że metanol jest schłodzony do -20 °C. Przygotuj, w tym sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), 5% normalnej surowicy końskiej (NHS) w PBS i 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS.

1. Wyrzucić pożywkę i umyć studzienki zawierające szkiełka nakrywkowe PBS. W zależności od stosowanych leków ważne może być prawidłowe wyrzucenie leków zawierających pożywki; Skontaktuj się z lokalnym urzędem ds. bezpieczeństwa środowiska w celu uzyskania szczegółowych instrukcji. Aby skutecznie umyć, napełnij butelkę do wyciskania PBS, odetnij końcówkę, aby umożliwić delikatny przepływ, a nie ciasny strumień, i użyj tego, aby dodać PBS do każdej studzienki po zassaniu oryginalnego PBS.
2. Utrwal komórki za pomocą ~250 μL 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej, RT pod delikatnym mieszaniem. Całkowicie przykryj górną część szkiełka nakrywkowego PFA; 250 μL powinno wystarczyć, ale jeśli nie, dodaj więcej. Należy zawsze unikać pipetowania bezpośrednio na szkiełka nakrywkowe, ponieważ niektóre komórki (lub metody leczenia komórek pod wpływem stresu) mogą zmienić przyczepienie, a siła pochodząca z pipetowania może spowodować ich przemieszczenie.
3. Usuń PFA i wyrzuć go w odpowiedni sposób. Skontaktuj się z lokalnym biurem ds. bezpieczeństwa środowiska, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat prawidłowego usuwania paraformaldehydu.
4. Dodać ~250 μl metanolu (-20 °C) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym kołysaniem; to zarówno przepuszczalnie, jak i spłaszcza komórki.
5. Usuń i wyrzuć metanol i zablokuj komórki, stosując ~250 μL 5% NHS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przez noc, O/N, w temperaturze 4 °C. Skontaktuj się z lokalnym biurem ds. bezpieczeństwa środowiska, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat prawidłowego usuwania metanolu.
6. W przypadku przeciwciał pierwszorzędowych należy rozcieńczyć przeciwciała w 5% NHS.
   nuta: Zastosowanie wielu markerów SG jest kluczem do potwierdzenia, czy zaobserwowane granulki są SG w dobrej wierze. Liczba markerów SG, które można zastosować, zależy od filtrów dostępnych w mikroskopie. Jeśli dostępne są standardowe zestawy filtrów zielonego, czerwonego i dalekiej czerwieni, należy użyć G3BP1, eIF4G i eIF3b w rozcieńczeniu 1/250.
   1. W tym eksperymencie (12 szkiełek nakrywkowych po 250 μl każdy-Razem: 3 ml 5% NHS) dodaj 12 μl każdego z poniższych: anty-G3BP1, anty-eIF3b i anty-eIF4G. Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C.
7. Przemyj studzienki 3x PBS i inkubuj każde płukanie przez 5 minut.
8. W przypadku przeciwciał drugorzędowych należy rozcieńczyć wszystkie przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczenie 1/250) i barwnik Hoechst (rozcieńczenie 1/1,000) w 5% NHS.
   1. W tym eksperymencie (12 szkiełek nakrywkowych po 250 μl każdy - Razem: 3 ml 5% NHS), dodaj 12 μl każdego z poniższych: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit i Cy5-Goat (rozcieńczenie 1/250 każdego) i dodaj 3 μl barwnika Hoechst.
   2. Szkiełka nakrywkowe inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Podczas tego i następnych etapów należy chronić próbki przed światłem, przykrywając płytkę pudełkiem lub umieszczając folię na wierzchu naczynia do hodowli tkankowej.
9. Umyj studzienki trzy razy PBS przez 5 minut każda.
10. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na oznakowanych szkiełkach podstawowych za pomocą medium montażowego. Podgrzewać materiał montażowy w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 10 minut; Zmniejsza to lepkość i ułatwia pipetowanie. Za pomocą wyciętej końcówki P200 odpipetować 25 μl medium montażowego na szkiełko nakrywkowe na szkiełko podstawowe; Na jednym szkiełku podstawowym może zmieścić się 4-8 szkiełek nakrywkowych, zakładając, że stolik mikroskopowy na to pozwala. Za pomocą drobnych kleszczyków przenieś szkiełko nakrywkowe ze studzienki na szkiełko, upewniając się, że kładziesz komórkę do dołu na podłożu montażowym. Używając czystej końcówki P200, dociśnij szkiełko nakrywkowe.
11. Po zamontowaniu wszystkich szkiełek nakrywkowych użyj złożonej chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar podłoża mocującego, bardzo mocno dociskając tkankę laboratoryjną do szkiełka. Użyj wyciśniętej butelki zawierającej_H2O, aby spłukać nadmiar podłoża mocującego, a następnie powtórz osuszanie złożoną tkanką laboratoryjną, aby usunąć wodę.

Wyniki

Rysunek 1: Schematy doświadczalne. (A) Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych uprzednio umieszczonych na płytce 24-dołkowej, jak wskazano. Traktuj rzędy A i B przez 60 minut SA lub VRB, stosując stężenie w μM, jak wskazano. Po 60 minutach dodać CHX (stężenie końcowe: 20 μg/ml dla kolumny 2) lub puro (20 μg/ml puromycyny dla kolumny 4) do pożywki zawierającej lek. Kontynuuj inku...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System operacyjny U-2	Kontroler ATCC (Kontroler T	ATCC®HTB-96™	- powszechnie zapisywany jako "U2OS" - hodowla w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 w 10% FBS/DMEM
Modyfikacja Dulbecco Eagle's Medium	Corning	10-013-CV	- w skrócie DMEM - zawiera 4,5 g/l glukozy, pirogronian i fenol red - uzupełniony o 10% FBS, 10 mM HEPES i penicylinę/steptomycynę - Rozcieńczenie wcześniejszego leku(ów) przed podgrzaniem - Przedgrzanie wcześniejszego rozcieńczenia leku (leków)
Surowica bydlęca płodu	Sigma	F2442-500ml	- w skrócie FBS - stosowany jako uzupełnienie pożywek
HEPESY (1 m)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 15630-080	- stosowany jako uzupełnienie pożywek
Penicylina Streptomycyna	Sigma	P0781-100ml	- stosowany jako uzupełnienie pożywek
Płytka 24-dołkowa	Costar	3524
Tkanki laboratoryjne	NAUKA KIMTECH	Numer katalogowy: 34120	- potocznie nazywane "chusteczkami kimwipes"
Szkło nakrywkowe do szkieł nakrywkowych wzrostu	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-545-82	- Autoklawowane przed użyciem - Utrzymuj sterylność w kapturze do hodowli tkankowych
(Meta)arsenit sodu ≥90%	Sigma	S7400-100G	- potocznie nazywany arsenitem sodu i w skrócie SA - rozpuszczenie w wodzie o stężeniu 1 M, a następnie rozcieńczenie do 100 μM jako zapas roboczy
Winorelbina	TSZ CHEM	Złącze RS055	- w skrócie VRB - rozpuszczają się w wodzie do 10 mM
Puromycyna	Sigma	Zobacz materiał P9620	- służy do oceny poziomu translacji (rybopuromycylacji) - służy do oceny związku SG z aktywnym tłumaczeniem - rozcieńczyć w wodzie do 10 mg/ml
Hydrat dichlorowodorku emetyny	Sigma	E2375	- Stosowany w połączeniu z Puro do oceny ogólnego poziomu tłumaczenia - służy do oceny związku SG z aktywnym tłumaczeniem - rozcieńczyć w wodzie do 10 mg/ml
Cykloheksymid	Sigma	Zobacz materiał C4859	- w skrócie CHX - służy do oceny związku SG z aktywnym tłumaczeniem - rozcieńczyć w wodzie do 10 mg/ml
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Lonza / VWR	Numer katalogowy: 95042-486	- w skrócie PBS - bufor do płukania immunofluorescencji
Odczynnik paraformaldehydowy, krystaliczny	Sigma	Zobacz materiał P6148-500G	- przygotować 4% roztwór w gorącym PBS w dygestorium, mieszać aż do rozpuszczenia - Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy - niebezpieczne, stosować wentylację - Wyrzucanie do odpadów specjalnych
Metanol, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- przed użyciem wstępnie schłodzone do temperatury -20°C - Wyrzucanie do odpadów specjalnych
Normalna surowica konia	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 31874	- w skrócie NHS - rozcieńczyć do 5% w PBS - dodać azydek sodu do przechowywania w temperaturze 4°C - roztwór blokujący immunofluorescencję
Etanol, czysty, 200 proof (100%),USP, KOPTEC	Decon Labs / VWR	89125-188	- rozcieńczyć wodą do 70%
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus	Marka rybacka	Numer katalogowy 12-550-15
Mysie przeciwciało anty G3BP1 (TT-Y)	Santa Cruz	SC-81940	- przechowywać w temperaturze 4 °C - stosować w rozcieńczeniu 1/100
Królicze przeciwciało anty eIF4G (H-300)	Santa Cruz	SC-11373	- przechowywać w temperaturze 4 °C - Rozcieńczenie 1/250
Przeciwciało anty eIF3η (N-20) kozy	Santa Cruz	SC-16377	- eIF3η jest również znany jako eIF3b - przechowywać w temperaturze 4 °C - Rozcieńczenie 1/250
Cy2 AffiniPure Donkey IgG przeciw mysim osiołkom (H+L)	Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona)	Nr kat. 715-225-150	- rozpuścić w wodzie zgodnie z instrukcją producenta, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C - Rozcieńczenie 1/250
Cy3 AffiniPure IgG przeciw królikom osłom (H+L)	Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona)	Nr kat. 711-165-152	- rozpuścić w wodzie zgodnie z instrukcją producenta, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C - Rozcieńczenie 1/2500
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona)	Tel. 705-175-147	- rozpuścić w wodzie zgodnie z instrukcją producenta, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C - Rozcieńczenie 1/250
Roztwór Hoechst 33258	Sigma	Zobacz materiał 94403-1ML	- inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi - roztwór podstawowy 0,5 mg/ml w dH20, chronić przed światłem - Przechowywać w temperaturze 4 °C
20 x bufor SSC	Thermo fisher Ambion	Zobacz materiał AM9763	- rozcieńczyć do 2X SSC przy użyciu wody wolnej od RNaz (poddanej działaniu DEPC) - przechowywać w temperaturze pokojowej - bufor do płukania FISH
Przesuwane nośniki montażowe	domowej roboty	/	- zmieszać 5 g "rozpuszczalnego na zimno" poli(alkoholu winylowego) w 20 ml PBS - wymieszać przez sonikację, a następnie mieszać przez noc w suchej temperaturze - Dodać 5 ml glicerolu i 0,2 ml 20 % azydku sodu i mieszać przez 16 godzin w temperaturze pokojowej - odwirować przy 20 000 g przez 20 minut, wyrzucić duże granulki - podwielokrotną lepką ciecz, długotrwałe przechowywanie w temperaturze -20°C, 1 tydzień w temperaturze 4°C
Parafilm "M"	Sigma	Zobacz materiał P7793-1EA	- zwykle określany jako "parafilm"
Poli(alkohol winylowy)	Sigma	P-8136-250G	- odczynnik do produkcji vinolu
glicerol	Sigma	G5516-100ML	- odczynnik do produkcji vinolu
Azydek sodu	Fisher Naukowy	S2002-5G	- Środek konserwujący do roztworu blokującego i vinolu - rozcieńczyć 20 % w wodzie

TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: