Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
911 wyświetleń
⸱
8 lipca 2025
Źródło: Aulas, A. et al., Metody klasyfikacji ognisk cytoplazmatycznych jako granulek stresu ssaków.J. Vis. Exp. (2017)
Ten film demonstruje test do charakteryzowania i ilościowego oznaczania granulek stresu u ssaków, które składają się z mRNA, białek wiążących RNA (RBP) i różnych innych białek.
1. Przygotowanie komórek
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Rysunek 1: Schematy doświadczalne. (A) Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych uprzednio umieszczonych na płytce 24-dołkowej, jak wskazano. Traktuj rzędy A i B przez 60 minut SA lub VRB, stosując stężenie w μM, jak wskazano. Po 60 minutach dodać CHX (stężenie końcowe: 20 μg/ml dla kolumny 2) lub puro (20 μg/ml puromycyny dla kolumny 4) do pożywki zawierającej lek. Kontynuuj inku.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System operacyjny U-2 | Kontroler ATCC (Kontroler T | ATCC®HTB-96™ | - powszechnie zapisywany jako "U2OS" - hodowla w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 w 10% FBS/DMEM |
| Modyfikacja Dulbecco Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | - w skrócie DMEM - zawiera 4,5 g/l glukozy, pirogronian i fenol red - uzupełniony o 10% FBS, 10 mM HEPES i penicylinę/steptomycynę - Rozcieńczenie wcześniejszego leku(ów) przed podgrzaniem - Przedgrzanie wcześniejszego rozcieńczenia leku (leków) |
| Surowica bydlęca płodu | Sigma | F2442-500ml | - w skrócie FBS - stosowany jako uzupełnienie pożywek |
| HEPESY (1 m) | Thermo Fisher Naukowy | Numer katalogowy: 15630-080 | - stosowany jako uzupełnienie pożywek |
| Penicylina Streptomycyna | Sigma | P0781-100ml | - stosowany jako uzupełnienie pożywek |
| Płytka 24-dołkowa | Costar | 3524 | |
| Tkanki laboratoryjne | NAUKA KIMTECH | Numer katalogowy: 34120 | - potocznie nazywane "chusteczkami kimwipes" |
| Szkło nakrywkowe do szkieł nakrywkowych wzrostu | Fisher Naukowy | Numer katalogowy: 12-545-82 | - Autoklawowane przed użyciem - Utrzymuj sterylność w kapturze do hodowli tkankowych |
| (Meta)arsenit sodu ≥90% | Sigma | S7400-100G | - potocznie nazywany arsenitem sodu i w skrócie SA - rozpuszczenie w wodzie o stężeniu 1 M, a następnie rozcieńczenie do 100 μM jako zapas roboczy |
| Winorelbina | TSZ CHEM | Złącze RS055 | - w skrócie VRB - rozpuszczają się w wodzie do 10 mM |
| Puromycyna | Sigma | Zobacz materiał P9620 | - służy do oceny poziomu translacji (rybopuromycylacji) - służy do oceny związku SG z aktywnym tłumaczeniem - rozcieńczyć w wodzie do 10 mg/ml |
| Hydrat dichlorowodorku emetyny | Sigma | E2375 | - Stosowany w połączeniu z Puro do oceny ogólnego poziomu tłumaczenia - służy do oceny związku SG z aktywnym tłumaczeniem - rozcieńczyć w wodzie do 10 mg/ml |
| Cykloheksymid | Sigma | Zobacz materiał C4859 | - w skrócie CHX - służy do oceny związku SG z aktywnym tłumaczeniem - rozcieńczyć w wodzie do 10 mg/ml |
| sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Lonza / VWR | Numer katalogowy: 95042-486 | - w skrócie PBS - bufor do płukania immunofluorescencji |
| Odczynnik paraformaldehydowy, krystaliczny | Sigma | Zobacz materiał P6148-500G | - przygotować 4% roztwór w gorącym PBS w dygestorium, mieszać aż do rozpuszczenia - Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy - niebezpieczne, stosować wentylację - Wyrzucanie do odpadów specjalnych |
| Metanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | - przed użyciem wstępnie schłodzone do temperatury -20°C - Wyrzucanie do odpadów specjalnych |
| Normalna surowica konia | Thermo Fisher Naukowy | Numer katalogowy: 31874 | - w skrócie NHS - rozcieńczyć do 5% w PBS - dodać azydek sodu do przechowywania w temperaturze 4°C - roztwór blokujący immunofluorescencję |
| Etanol, czysty, 200 proof (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | - rozcieńczyć wodą do 70% |
| Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus | Marka rybacka | Numer katalogowy 12-550-15 | |
| Mysie przeciwciało anty G3BP1 (TT-Y) | Santa Cruz | SC-81940 | - przechowywać w temperaturze 4 °C - stosować w rozcieńczeniu 1/100 |
| Królicze przeciwciało anty eIF4G (H-300) | Santa Cruz | SC-11373 | - przechowywać w temperaturze 4 °C - Rozcieńczenie 1/250 |
| Przeciwciało anty eIF3η (N-20) kozy | Santa Cruz | SC-16377 | - eIF3η jest również znany jako eIF3b - przechowywać w temperaturze 4 °C - Rozcieńczenie 1/250 |
| Cy2 AffiniPure Donkey IgG przeciw mysim osiołkom (H+L) | Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona) | Nr kat. 715-225-150 | - rozpuścić w wodzie zgodnie z instrukcją producenta, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C - Rozcieńczenie 1/250 |
| Cy3 AffiniPure IgG przeciw królikom osłom (H+L) | Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona) | Nr kat. 711-165-152 | - rozpuścić w wodzie zgodnie z instrukcją producenta, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C - Rozcieńczenie 1/2500 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona) | Tel. 705-175-147 | - rozpuścić w wodzie zgodnie z instrukcją producenta, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C - Rozcieńczenie 1/250 |
| Roztwór Hoechst 33258 | Sigma | Zobacz materiał 94403-1ML | - inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi - roztwór podstawowy 0,5 mg/ml w dH20, chronić przed światłem - Przechowywać w temperaturze 4 °C |
| 20 x bufor SSC | Thermo fisher Ambion | Zobacz materiał AM9763 | - rozcieńczyć do 2X SSC przy użyciu wody wolnej od RNaz (poddanej działaniu DEPC) - przechowywać w temperaturze pokojowej - bufor do płukania FISH |
| Przesuwane nośniki montażowe | domowej roboty | / | - zmieszać 5 g "rozpuszczalnego na zimno" poli(alkoholu winylowego) w 20 ml PBS - wymieszać przez sonikację, a następnie mieszać przez noc w suchej temperaturze - Dodać 5 ml glicerolu i 0,2 ml 20 % azydku sodu i mieszać przez 16 godzin w temperaturze pokojowej - odwirować przy 20 000 g przez 20 minut, wyrzucić duże granulki - podwielokrotną lepką ciecz, długotrwałe przechowywanie w temperaturze -20°C, 1 tydzień w temperaturze 4°C |
| Parafilm "M" | Sigma | Zobacz materiał P7793-1EA | - zwykle określany jako "parafilm" |
| Poli(alkohol winylowy) | Sigma | P-8136-250G | - odczynnik do produkcji vinolu |
| glicerol | Sigma | G5516-100ML | - odczynnik do produkcji vinolu |
| Azydek sodu | Fisher Naukowy | S2002-5G | - Środek konserwujący do roztworu blokującego i vinolu - rozcieńczyć 20 % w wodzie |
