Artykuł metodologiczny

Pomiar ładunku bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznych u myszy zainfekowanych Listeria monocytogenes

31.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3076

⸱

9 sierpnia 2011

 ,  ,  , 
1St Vincent’s Institute, Department of Medicine, The University of Melbourne, 2Department of Microbiology and Immunology, The University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

Listeria monocytogenes jest organizmem modelowym do badania odpowiedzi immunologicznych i genetycznej podatności myszy na bakterie wewnątrzkomórkowe. Metoda ta umożliwia pomiar ładunku bakteryjnego oraz przygotowanie jednokomórkowych zawiesin wątroby i śledziony myszy do analizy FACS w celu określenia zmian w komórkach odpornościowych wywołanych zakażeniem Listeria.

Streszczenie

Listeria monocytogenes (Listeria) jest Gram-dodatnim, fakultatywnym patogenem wewnątrzkomórkowym1W badaniach na myszach zazwyczaj stosuje się iniekcję dożylną Listeriaco prowadzi do zakażenia systemowego2Po wstrzyknięciu Listeria szybko rozprzestrzenia się do śledziony i wątroby w wyniku wychwytu przez komórki CD8α+ komórki dendrytyczne i komórki Kupffera3,4Po fagocytozie różne białka bakteryjne umożliwiają Listeria aby wydostać się z fagosomu, przeżyć w cytosolu i zainfekować sąsiednie komórki5Podczas pierwszych trzech dni infekcji różne komórki odporności nieswoistej (np. monocyty, neutrofile, komórki NK, komórki dendrytyczne) pośredniczą w mechanizmach bakteriobójczych, które minimalizują Listeria proliferacja. CD8+ Następnie rekrutowane są limfocyty T, które odpowiadają za ostateczne usunięcie Listeria z organizmu gospodarza, zazwyczaj w ciągu 10 dni od zakażenia6.

Skuteczne usunięcie Listeria z organizmu zakażonych myszy zależy od odpowiedniego momentu uruchomienia odpowiedzi immunologicznej gospodarza6. Wśród wchłoniętych szczepów myszy występuje szeroki zakres wrażliwości7,8. Zazwyczaj myszy o zwiększonej podatności na zakażenie Listeria słabiej kontrolują proliferację bakteryjną, co objawia się zwiększonym mianem bakterii i/lub opóźnionym usuwaniem patogenu w porównaniu z myszami odpornymi. Badania genetyczne, w tym analizy sprzężeń oraz zastosowanie szczepów myszy z nokautem, pozwoliły zidentyfikować różne geny, których wariancja sekwencji wpływa na odpowiedź gospodarza na zakażenie Listeria6,8-14. Wyznaczenie i porównanie kinetyki zakażenia pomiędzy różnymi szczepami myszy jest zatem istotną metodą identyfikacji genetycznych czynników gospodarza, które przyczyniają się do odpowiedzi immunologicznej przeciwko Listeria. Porównanie odpowiedzi gospodarza na różne szczepy Listeria jest również skutecznym sposobem identyfikacji bakteryjnych czynników wirulencji, które mogą służyć jako potencjalne cele dla antybiotykoterapii lub projektowania szczepionek.

Opisujemy tutaj prostą metodę pomiaru ładunku bakteryjnego (jednostek tworzących kolonie [CFU] na tkankę) oraz przygotowania zawiesin pojedynczych komórek wątroby i śledziony do analizy FACS odpowiedzi immunologicznych u myszy zainfekowanych Listeria. Metoda ta jest szczególnie użyteczna przy wstępnej charakterystyce infekcji Listeria w nowych szczepach myszy, a także przy porównywaniu odpowiedzi immunologicznych między różnymi szczepami myszy zainfekowanymi Listeria. Wykorzystujemy szczep Listeria monocytogenes EGD15, który po wysianiu na agar krwi wykazuje charakterystyczną strefę halo wokół każdej kolonii z powodu β-hemolizy1 (Rycina 1). Ładunek bakteryjny i odpowiedzi immunologiczne można oznaczyć w dowolnym punkcie czasowym po infekcji, hodując homogenat tkankowy na płytkach z agarem krwi i przygotowując zawiesiny komórek tkankowych do analizy FACS zgodnie z opisanymi poniżej protokołami. Zaznaczamy, że osoby z niedoborem odporności lub kobiety w ciąży nie powinny pracować z Listeria, a przed rozpoczęciem prac należy skonsultować się z odpowiednią instytucjonalną komisją ds. bezpieczeństwa biologicznego oraz kierownictwem weterynarium.

Protokół

1. Hodowla i długoterminowe przechowywanie Listeria monocytogenes (Listeria)

  1. Przygotuj lub zakup gotowe płytki z agarem z krwią konia (HBA). Przed użyciem osusz płytki poprzez inkubację w temperaturze 37°C przez noc lub pozostawienie ich bez przykrycia w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 1 godzinę.
  2. Pozyskaj żywe szczepy Listeria z jednego z następujących źródeł: homogenatu tkanki zakażonej myszy, zapasu liofilizowanego, zamrożonego zapasu w glicerolu lub kolonii z niedawnej hodowli Listeria (tj. starszej niż tydzień i niepodlewanej więcej niż 10 pokoleń). Wszystkie szczepy Listeria należy pobierać za pomocą sterylnej pętli do szczepienia, stosując techniki aseptyczne we wszystkich metodach opisanych w niniejszym protokole.
  3. Wykonaj posiew Listeria na płytce HBA zgodnie z rysunkiem 1, używając sterylnej pętli do szczepienia: rozprowadź Listeria na ¼ powierzchni płytki jako pierwotny inokulum. Wykonaj serię jednokierunkowych kresek od pierwotnego obszaru posiewu. Powtórz czynność 2-3 razy, używając nowej lub ponownie wysterylizowanej pętli przed każdym zestawem kresek. Inkubuj płytki w temperaturze 37°C przez noc.
  4. Przechowuj płytkę HBA z Listeria w temperaturze 4°C przez maksymalnie 1 miesiąc lub przejdź do kroku 1.5, aby przygotować hodowlę Listeria do długotrwałego przechowywania.
  5. Pobierz pojedynczą kolonię ze świeżej hodowli Listeria na płytce HBA za pomocą wysterylizowanej pętli do szczepienia i zaszczep 10 mL bulionu brain heart infusion (BHI) (przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta) w butelce McCartneya o pojemności 30 mL.
  6. Inkubuj hodowlę Listeria w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną przy 180rpm w temperaturze 37°C przez noc.
  7. Dodaj sterylny 80% glicerol (v/v) do płynnej hodowli Listeria w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie glicerolu 40% (v/v). Przenieś aliquoty 0.5-1 mL do krioprobek i przechowuj zapasy Listeria/glicerol w temperaturze -70°C.

Wskazówki i uwagi:

  • Wzrost Listeria można prowadzić na różnych pożywkach nieselektywnych, takich jak rodzaje agaru z krwią (uzupełnionego krwią konia, owcy, świnki morskiej lub człowieka), agar lub bulion BHI (brain heart infusion) lub bulion sojowy z ekstraktem drożdżowym (TSB-YE). Wzrost zanieczyszczeń w kulturze można zminimalizować poprzez dodanie do pożywki antybiotyków dla szczepów Listeria o określonej oporności na antybiotyki (np. L. monocytogenes 10403S) lub poprzez zastosowanie pożywek Oxford, które selektywnie wspierają wzrost Listeria.
  • Jeśli Listeria pochodzi z nieprzebadanego źródła, zaleca się przeprowadzenie dodatkowych testów w celu potwierdzenia tożsamości Listeria (L. monocytogenes jest Gram-dodatni, nie tworzy przetrwalników, jest ruchliwy w temperaturze <30°C, fakultatywnie beztlenowy, katalaza-dodatni i oksydaza-ujemny). Uzyskaną kulturę można również hodować na pożywkach selektywnych dla Listeria, aby upewnić się, że uzyskano kulturę czystą.
  • Osuszanie płytek HBA zapewnia optymalną separację kolonii bakterii na płytce.
  • Podczas przygotowywania mrożonych stoków glicerolowych Listeria, należy używać świeżych kultur Listeria na HBA, które mają mniej niż 1 tydzień i zostały podpasażowane przez jak najmniejszą liczbę generacji (najlepiej <5).
  • Przy pozyskiwaniu świeżych kultur Listeria z mrożonego stoku glicerolowego, pierwszy pasaż powinien zostać wykonany na pożywce stałej (tj. na płytkach HBA), ponieważ Listeria pochodzące z mrożonych stoków glicerolowych słabo rosną przy bezpośrednim pasażowaniu w pożywce płynnej.

2. Przygotowanie i przechowywanie zakaźnego zapasu Listeria do badań nad infekcją in vivo

  1. Wykonać posiew Listeria z mrożonego zapasu w glicerolu (krok 1.7) na płytkę HBA zgodnie z opisem w kroku 1.3. Inkubować płytki w temperaturze 37°C przez noc w celu wykorzystania następnego dnia.
  2. Wybrać pojedynczą kolonię Listeria z kultury posiewowej i zaszczepić ją do 10 mL bulionu BHI. Unikać przenoszenia agaru do bulionu.
  3. Inkubować kulturę Listeria w bulionie BHI w inkubatorze wytrząsowym przy 180 rpm i 37°C do średniej fazy logarytmicznej (OD600 = ~0,4). Zazwyczaj trwa to 3-4 godziny.
  4. Aseptycznie pobrać aliquotę 0,9 mL i zmierzyć wartość OD przy 600 nm po 3-4 godzinach wytrząsania. Jeśli wartość OD jest <0,3, kontynuować hodowlę w inkubatorze wytrząsowym przy 180 rpm i 37°C, aż wartość OD osiągnie ~0,4.
  5. Dodać 1 mL sterylnego 80% glicerolu (v/v) do 10 mL kultury Listeria w bulionie BHI (OD600 ~0,4). Delikatnie wymieszać i przenieść do probówek do wirówki o pojemności 1,5 mL w aliquotach 0,5-1 mL.
  6. Umieścić aliquoty w lodzie na 10 min, a następnie przechowywać w temperaturze -70°C. Pozostawić jedną aliquotę niezamrożoną, aby określić stężenie Listeria w zapasie zakaźnym, które zazwyczaj wynosi około 109 CFU/mL.
  7. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:10 niezamrożonego zapasu zakaźnego Listeria w PBS do rozcieńczenia 10-8. Rozsiać 100 μL niepozamrożonego oraz każdego kolejnego rozcieńczenia na uprzednio osuszone płytki HBA (krok 1.1) w dwóch powtórzeniach, używając szklanego roznosiciela. Inkubować płytki w temperaturze 37°C przez noc.
  8. Policzyć liczbę kolonii na każdej płytce i określić stężenie Listeria w mrożonym zapasie zakaźnym, korzystając z następnego obliczenia: stężenie (CFU/mL) = liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia / 0,1 mL. Płytki wybrane do liczenia powinny idealnie zawierać od 30 do 300 kolonii, aby zapewnić wiarygodną ocenę stężenia CFU żywych bakterii.
  9. Kilka dni po przechowywaniu zapasu zakaźnego Listeria w -70°C rozmrozić jedną probówkę. Określić stężenie żywych Listeria zgodnie z opisem w krokach 2.7 i 2.8. Stężenie to powinno być zbliżone do stężenia ustalonego dla świeżo przygotowanego zapasu zakaźnego w kroku 2.8.

Wskazówki i uwagi:

  • Zakaźny materiał Listeria jest mrożony w niższym stężeniu glicerolu (8%) niż w przypadku mrożenia Listeria do ogólnego długoterminowego przechowywania (40%).
  • Zamrożone zakaźne materiały Listeria są zazwyczaj stabilne w temperaturze -70°C przez okres do 3 miesięcy. W przypadku użytkowania po upływie 3 miesięcy zaleca się przygotowanie nowego zakaźnego materiału ze świeżej kultury Listeria na płytce HBA.
  • Jeśli stężenie rozmrożonego zakaźnego materiału Listeria (krok 2.9) różni się od świeżo przygotowanego materiału opisanego w krokach 2.7 i 2.8 (tj. spadek CFU o >20%), należy przygotować nowy zamrożony zakaźny materiał.
  • Choć początkowo przygotowanie zamrożonych zakaźnych materiałów Listeria jest bardziej czasochłonne niż przygotowanie świeżego inokulum bakteryjnego dla pojedynczego eksperymentu, pozwala ono na dokładne określenie stężenia CFU przed zakażeniem i zapewnia lepszą powtarzalność między eksperymentami, gdy myszy są zakażane z tego samego zamrożonego materiału.

3. Przygotowanie inokulum Listeria i wstrzyknięcie dożylne myszom

  1. Określ stężenie Listeria do wstrzyknięcia na jedną mysz. W przypadku iniekcji dożylnej stosuje się liczbę CFU w 200 μL inokulum na mysz.
  2. Rozmroź zamrożoną alikwotową porcję zakaźnego zapasu Listeria (z kroku 2.6). Rozcieńcz zapas zakaźny w PBS do pożądanego stężenia CFU Listeria. Przygotuj dwukrotność objętości potrzebnej do wstrzyknięcia wszystkim myszom, aby zapewnić wystarczającą ilość inokulum do iniekcji oraz do oznaczenia CFU Listeria przed i po wstrzyknięciu (krok 3.3 i 3.7).
  3. Pobierz 2x 0,1 mL alikwotów z przygotowanego inokulum Listeria i przygotuj rozcieńczenie 1:10 w PBS dla każdego alikwotu przed wstrzyknięciem myszom. Wysiej 0,1 mL każdego rozcieńczenia na płytki HBA i inkubuj płytki przez noc w 37°C. Policz liczbę kolonii i określ stężenie inokulum Listeria przed iniekcją: stężenie (CFU/mL) = (liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia) / mL wysianych dla tego współczynnika rozcieńczenia.
  4. Przenieś mysz do wstrzyknięcia do czystej klatki. Ogrzej mysz, umieszczając klatkę w odległości ok. 50 cm pod lampą podczerwoną o mocy 250 W przez 5 min (można również użyć innych odpowiednich urządzeń termicznych, które nie oparzą myszy ani nie podniosą temperatury w klatce powyżej 40°C). Umieść mysz w urządzeniu stabilizującym do iniekcji w żyłę ogonową.
  5. Delikatnie wymieszaj zawiesinę Listeria, aby utrzymać jednolite zawieszenie przy każdym napełnianiu strzykawki.
  6. Zlokalizuj boczną żyłę ogonową myszy, delikatnie przemyj ją gazikiem z 70% etanolem i wstrzyknij 200 μL inokulum Listeria (o pożądanym stężeniu) za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 27 G. Krótko uciśnij miejsce wkłucia sterylną gazą. Wróć mysz do klatki.
  7. Po zakończeniu iniekcji u wszystkich myszy powtórz krok 3.3, używając pozostałej ilości inokulum, aby określić stężenie inokulum Listeria po iniekcji.
  8. Ilość Listeria wstrzyknięta myszom jest raportowana jako średnia liczba CFU wyznaczona z próbek inokulum Listeria przed i po iniekcji.

Wskazówki i uwagi:

  • Zazwyczaj wstrzykujemy 500 - 3 000 CFU (200 μL inokulum o stężeniu 2 500 CFU/mL - 15 000 CFU/mL) podczas porównywania obciążenia bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznych pomiędzy szczepem myszy opornym (np. C57BL/6) a szczepem myszy podatnym (np. BALB/c).
  • Jeśli zapas zakaźny zostanie rozcieńczony w PBS co najmniej 105 razy, etap płukania w celu usunięcia pozostałości pożywki/glicerolu zazwyczaj nie jest wymagany. Jeśli zapas zakaźny nie zostanie rozcieńczony w PBS co najmniej 105 razy, do kroku 3.2 należy dodać etap płukania w celu usunięcia pozostałości pożywki/glicerolu w następujący sposób: do rozmrożonego zapasu zakaźnego dodać 9 mL PBS i zebrać bakterie poprzez wirowanie przy 2100 x g przez 10 min w 4°C. Usunąć supernatant i resuspender osad komórek bakteryjnych w 10 mL sterylnego PBS, powtórzyć wirowanie, a następnie resuspender osad komórek bakteryjnych w pożądanej objętości. Wyznaczyć średnią liczbę CFU z próbek inokulum Listeria przed i po wstrzyknięciu, zgodnie z opisem w krokach 3.3 i 3.7. Należy zauważyć, że etap płukania może spowodować utratę części bakterii; zaleca się, aby taką stratę określić wcześniej i uwzględnić ją podczas przygotowywania inokulum o wymaganej koncentracji.
  • Po wstrzyknięciu Listeria myszy w bezpieczny sposób zutylizować strzykawkę i igłę.

4. Pobieranie wątroby i śledziony z myszy zainfekowanych Listeria do analizy

  1. Uśmierć zakażaną mysz w wybranym punkcie czasowym po zakażeniu, stosując metodę zatwierdzoną przez lokalną Komisję Etyki ds. Doświadczeń na Zwierzętach, np. poprzez uduszenie CO2.
  2. Niezwłocznie po uśmierceniu wykonaj pobranie krwi z serca, używając strzykawki 1 mL i igły 25 G. Zbierz jak największą ilość krwi. Usuń pęcherzyk żółciowy i przetnij żyłę główną dolną.
  3. Odsłoń żyłę wrotna wątroby, ostrożnie przesuwając jelita w prawą stronę; odchyl płaty wątroby w stronę głowy i w lewo, tak aby wątroba znajdowała się w miejscu przepony. Żyła wrotna doprowadza krew do dolnej części wątroby z prawej strony.
  4. Przepłucz wątrobę, wstrzykując 10 mL PBS do żyły wrotnej za pomocą igły 26 G. PBS wstrzyknięty przez żyłę wrotną wypłynie przez przetniętą żyłę główną dolną. Perfuzja wątroby zapewnia, że pobrane komórki pochodzą z miąższu wątroby, a nie z krwi krążącej.
  5. Wyjmij przepłukaną wątrobę z jamy brzusznej myszy, umieść w buforze FACS i przechowuj w lodzie. Przejdź do kroku 5.1 w celu przygotowania wątroby do analizy FACS.
  6. Usuń śledzionę z organizmu myszy, umieść w buforze FACS i przechowuj w lodzie.
  7. Zważ całą śledzionę, przetnij ją na pół i zważ jedną z połówek. Jedną połówkę umieść w buforze FACS i przejdź do kroku 6.1. Drugą połówkę umieść w worku do homogenizatora Stomacher w lodzie i przejdź do kroku 7.1.

Wskazówki i uwagi:

  • W krokach 4.5 i 4.6 należy użyć odpowiedniej ilości buforu FACS, aby całkowicie zanurzyć tkankę i zminimalizować ekspozycję jakiejkolwiek jej części na powietrze.
  • Igła 26G o długości ½ cala, wygięta pod kątem około 30 stopni, może ułatwić wstrzyknięcie PBS do żyły wrotnej wątroby.
  • Przy prawidłowej perfuzji wątroba zmienia kolor z ciemnoczerwonego na jasnobrązowy po wstrzyknięciu 1-2 mL PBS.
  • Jeśli wątroba nie jest wymagana do analizy FACS, perfuzja nie jest konieczna. Wątrobę można wyizolować i zebrać bezpośrednio do worka do homogenizatora Stomacher, a następnie przetworzyć zgodnie z opisem w kroku 7.
  • W przypadku eutanazji myszy preferowaną metodą jest uśpienie przez CO2, ponieważ ma ono minimalny wpływ na CFU bakterii oraz żywotność komórek odpornościowych w śledzionie i wątrobie. Jeśli pobranie krwi nie jest wymagane, jako alternatywną metodę eutanazji można zastosować zwichnięcie karku. Zaleca się niestosowania metod eutanazji, które mogą wpływać na masę organów lub żywotność komórek odpornościowych (np. tiobarbituratów).

5. Przygotowanie zawiesiny komórek wątroby do analizy FACS

  1. Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, umieszczając wątrobę wraz z buforem FACS (krok 4.5) w sitku komórkowym o oczkach 70 μm umieszczonym w szalce Petriego o średnicy 60 mm. Przecisnąć tkankę przez sitko za pomocą tłoka strzykawki 5 mL, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
  2. Przenieść zawiesinę pojedynczych komórek wątroby z szalki Petriego do stożkowej probówki 50 mL z nakrętką i uzupełnić całkowitą objętość do 40 mL zimnym buforem FACS.
  3. Wymieszać zawiesinę komórkową na wortexie i pobrać alikwot 1 mL w celu oznaczenia ładunku bakteryjnego wątroby. Przejść do kroku 7.3 i użyć tego alikwotu 1 mL zamiast homogenatu tkankowego w worku do Stomachera.
  4. Osadzić komórki poprzez wirowanie przy 500 x g przez 5 min w temperaturze 4°C, odrzucić nadsącz, resuspendować osad w 40 mL zimnego buforu FACS, ponownie osadzić komórki przez wirowanie przy 500 x g przez 5 min w temperaturze 4°C i odrzucić nadsącz.
  5. Resuspendować osad komórkowy w 20 mL izotonicznego Percollu w temperaturze pokojowej. Wirować zawiesinę komórkową przy 700 x g przez 12 min w temperaturze pokojowej. Odrzucić nadsącz oraz pływającą na powierzchni warstwę komórek w kształcie dysku (tj. hepatocyty). Resuspendować osad zawierający leukocyty w 4 mL buforu TAC w celu lizy erytrocytów i inkubować komórki w temperaturze pokojowej do 10 min, często odwracając probówkę.
  6. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez nylonową membranę o oczkach 100 μm do nowej probówki wirówkowej 10 mL.
  7. Podłożyć pod przefiltrowaną zawiesinę komórkową 1 mL buforu FCS/EDTA. Wirować przy 350 x g przez 5 min w temperaturze 4°C, odrzucić nadsącz i resuspendować w 5 mL buforu FACS/EDTA.
  8. Wirować zawiesinę komórkową przy 350 x g przez 5 min w temperaturze 4°C, odrzucić nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 0,5-3 mL buforu FACS/EDTA, w zależności od wielkości osadu.
  9. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową w błękicie trypanu w stosunku 1:5-1:20, zależnie od objętości zawiesiny z kroku 5.8. Policzyć żywe leukocyty wątrobowe za pomocą komory countingowej (Rysunek 4A) i obliczyć całkowitą liczbę żywych komórek według wzoru: żywe komórki/narząd = liczba komórek w polu liczenia x czynnik rozcieńczenia x 104 x objętość (mL). Zawiesiny pojedynczych komórek wątroby można następnie znakować przeciwciałami specyficznymi dla wybranych markerów powierzchniowych i analizować metodą FACS.

Wskazówki i uwagi:

  • Przechowywać komórki w lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.

6. Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny śledziony do analizy FACS

  1. Przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek, umieszczając jedną połowę śledziony (krok 4.7) wraz z buforem FACS w sitku do komórek o rozmiarze 70 μm znajdującym się w 60 mm szalce Petriego. Delikatnie przepchnij tkankę przez sitko, używając tłoka strzykawki 5 mL, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
  2. Przenieś zawiesinę pojedynczych komórek śledziony z szalki Petriego do probówki do wirowania o pojemności 10 mL i uzupełnij całkowitą objętość do 10 mL, używając zimnego buforu FACS.
  3. Osadź komórki poprzez wirowanie przy 350 x g przez 5 min w temperaturze 4°C, odlej supernatant, resuspenduj osad komórkowy w 4 mL buforu TAC w celu lizy erytrocytów i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej do 10 min, często odwracając probówkę.
  4. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez nylonową membranę o rozmiarze 100 μm do nowej probówki do wirowania o pojemności 10 mL.
  5. Podlej przefiltrowaną zawiesinę komórkową 1 mL buforu FCS/EDTA. Wirować przy 350 x g przez 5 min w 4 °C, odlać supernatant i resuspendować osad komórkowy w 5 mL buforu FACS/EDTA.
  6. Wirować zawiesinę komórkową przy 350 x g przez 5 min w 4°C, odlać supernatant i resuspendować osad komórkowy w 3-8 mL buforu FACS/EDTA, w zależności od wielkości osadu.
  7. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową w stosunku 1:10 – 1:20 w błękicie trypanu (0,4% w wodzie destylowanej), zależnie od objętości zawiesiny z kroku 7.6. Policz żywe splenocyty za pomocą hemocytometru – patrz Krok 5.9 w celu obliczenia całkowitej liczby żywych komórek na organ. Zawiesiny pojedynczych komórek śledziony można następnie znakować przeciwciałami specyficznymi dla wybranych markerów powierzchni komórkowej i analizować metodą FACS.

Wskazówki i uwagi:

  1. Przechowuj komórki w lodzie, chyba że wskazano inaczej.

7. Pomiar ładunku bakteryjnego w tkankach myszy zainfekowanych Listeria

  1. Zagiąć górną część worka do homogenizatora Stomacher zawierającego połowę śledziony. Trzymając worek zamknięty, aby zapobiec wyciekom, położyć go płasko na czystym stole laboratoryjnym lub w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przetaczać gruby okrągły długopis po tkance, aż zostanie ona rozgnieciona wewnątrz worka.
  2. Do każdego worka Stomacher z rozgniecioną tkanką dodać 5 ml PBS. Umieścić worek w homogenizatorze Stomacher i uruchomić urządzenie na wysokich obrotach przez 10 minut.
  3. Wymieszać homogenizat w worku Stomacher (lub 1 mL alikwot zawiesiny komórek wątroby) za pomocą pipety. Poniższe czynności wykonać w duplikacie. Przenieść 300 μL do 96-dołkowej płytki z płaskim dnem. W dołkach płytki 96-dołkowej wykonać rozcieńczenia seryjne 1:10 (30 μL do 270 μL PBS) do rozcieńczenia 10-5 dla każdej próbki homogenizatu tkankowego.
  4. Ostrożnie rozprowadzić 0,1 mL każdego rozcieńczenia na uprzednio wysuszonej płytce HBA za pomocą szklanego rozpylacza. Inkubować płytki w temperaturze 37°C przez noc.
  5. Policzyć liczbę CFU dla każdego rozcieńczenia i obliczyć liczbę CFU na tkankę, biorąc pod uwagę część tkanki (np. połowę śledziony), czynnik rozcieńczenia oraz całkowitą objętość homogenizatu tkankowego (5 mL lub 40 mL): CFU/tkanka = CFU/0,1 mL x czynnik rozcieńczenia x mL/tkanka; w przypadku śledziony podzielić tę liczbę przez procentową wagę próbki śledziony użytej do homogenizacji tkanki (patrz krok 4.7).

Wskazówki i uwagi:

  • W urządzeniu Stomacher można jednocześnie umieścić więcej niż jeden worek do homogenizacji, pod warunkiem że całkowita objętość nie przekrocza maksymalnej objętości określonej przez producenta
  • W przypadku braku urządzenia Stomacher można zastosować homogenizator do tkanek. Alternatywnie, choć mniej wydajna, można zastosować poniższą metodę ręcznego macerowania narządu zamiast kroków 7.1 i 7.2: należy umieścić narząd w szczelnym, sterylizowanym plastikowym worku i położyć go na czystej szafce laminarnej, trzymając worek zamkniętym, aby zapobiec wyciekom. Należy wielokrotnie przetaczać szklaną butelkę laboratoryjną o pojemności 500 mL po worku, aż tkanka zostanie całkowicie rozdrobniona. Do każdego worka należy dodać 5 mL PBS i przejść do kroku 7.3.
  • W kroku 7.4 bardzo ważne jest, aby płytki HBA były dokładnie wysuszone (tj. aby na agarze nie było wilgoci). W przeciwnym razie trudno może być uzyskać wyraźne kolonie Listeria, które można by prawidłowo policzyć.
  • W przypadku ograniczonej liczby płytek HBA, alternatywny krok 7.4 polega na: narysowaniu linii na spodzie uprzednio wysuszonej płytki HBA (Krok 1.1), aby podzielić ją na pięć do sześciu sekcji, po jednej dla każdego rozcieńczenia. Należy ostrożnie nanieść pipetą 25 μL każdego rozcieńczenia do odpowiednich sekcji na płytce HBA dla każdego homogenatu tkankowego – nie należy rozprowadzać próbki za pomocą rozpora. Należy odczekać, aż krople homogenatu tkankowego wyschną, przed odwróceniem płytki. Płytkę należy inkubować w temperaturze 37°C przez noc. Dzięki zastosowaniu jednej kropli na płytce agarowej można rozróżnić do 80 kolonii.
  • Rozcieńczenie homogenatów tkankowych może zależeć od wzrostu Listeria w organizmie zwierzęcia i może być szacowane na podstawie objawów wykazanych przez zwierzę w momencie eutanazji. W przypadku myszy wyraźnie moribundnych może być konieczne zastosowanie dodatkowych rozcieńczeń w celu dokładniejszego określenia ładunku bakteryjnego. W przypadku myszy inokulowanych niskimi dawkami Listeria lub myszy poddanych eutanazji pod koniec okresu infekcji, do oznaczenia ładunku bakteryjnego można użyć nierozcieńczonego homogenatu tkankowego.
  • Płytki można inkubować w temperaturze 37°C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni.

8. Reprezentatywne wyniki:

W celu przeprowadzenia standardowego eksperymentu z infekcją, Listeria została pobrana z zamrożonego zapasu w glicerolu i wysiana na płytkę HBA, zgodnie z ilustracją na Rysunku 1. Jeśli po wysianiu uzyskano niewiele kolonii, może to świadczyć o nieprawidłowej technice wysiewu lub o niskiej jakości zapasu mrożonego. Zakaźny zapas Listeria przygotowano ze świeżo wysianej płytki HBA i przechowywano w temperaturze -70°C. Do pomiaru klirensu bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznej rutynowo rozcieńczamy rozmrożony zakaźny zapas Listeria do stężenia 2 500 CFU/mL - 15 000 CFU/mL i wstrzykujemy myszom 200 μL, aby zainfekować je dawką 500 - 3 000 CFU. Zaobserwowano, że myszy zainfekowane subletalnymi dawkami Listeria zgodnie z tym protokołem mogą przejściowo wykazywać zwichrzoną sierść, zgarbioną postawę oraz utratę masy ciała w ciągu pierwszych kilku dni. Objawy te stanowią wizualną wskazówkę dotyczącą stopnia dotknięcia poszczególnej myszy infekcją, pozwalają ocenić, czy osobnik reaguje inaczej niż reszta grupy (tj. czy jest „oczywistym” outlierem) oraz czy konieczna jest eutanazja w celu zapobieżenia nadmiernemu cierpieniu i nieuchronnej śmierci w wyniku infekcji.

W wynikach przedstawionych na Rysunkach 2-5 myszy zakażono przy użyciu świeżo rozmrożonej aликwoty Listeria zasób zakaźny. W różnych punktach czasowych po zakażeniu myszy uśmiercano, a następnie pobierano wątrobę i śledzionę. Rysunek 2 przedstawia płytkę HBA, na której hodowano rozcieńczony homogenat śledziony od jednej myszy. Liczba kolonii powinna wyraźnie spadać wraz ze wzrostem stopnia rozcieńczenia, tak aby możliwe było przeliczenie poszczególnych CFU dla co najmniej dwóch rozcieńczeń. Jeśli organizm myszy wyeliminował Listeria infekcji (tj. granica wykrywalności = 100 CFU/tkankę), to następnie <5 Listeria na płytce HBA, na której naniesiono metodą posiewu rozlewnego, obecne będą kolonie 200 μL nie-rozcieńczonego homogenatu tkankowego. Jeśli podczas izolacji wątroba i/lub śledziona zostaną zanieczyszczone bakteriami jelitowymi lub innymi bakteriami zewnętrznymi, kolonie na płytce HBA prawdopodobnie będą wykazywać inną morfologię (t.j. nie będą posiadały charakterystycznego halo i bladego koloru). Listeria kolonie) i/lub liczba kolonii może odbiegać od wartości oczekiwanych dla Listeria (tj. zbyt mało lub zbyt wiele). Rycina 3 przedstawia typowy Listeria krzywa klirensu dla myszy C57BL/6 – należy zauważyć, że Listeria są zazwyczaj usuwane ze śledziony szybciej niż z wątroby, a proces ten nie rozpoczyna się przed upływem pięciu dni od zakażenia.

Rysunek 4 przedstawia liczbę komórek na podstawie zawiesin jednokomórkowych przygotowanych ze śledziony i wątroby zarażonych myszy w różnych punktach czasowych po infekcji. Metoda ta pozwala uzyskać czystość leukocytów >95% w zawiesinach jednokomórkowych przygotowanych z wątroby i >80% ze śledziony. Czystość leukocytów można określić za pomocą analizy FACS z użyciem przeciwciała monoklonalnego specyficznego dla pan-markeru leukocytarnego CD45 (klon 30-F11). Typowo liczba splenocytów i leukocytów wątrobowych wzrasta w okresie potrzebnym do zwalczenia infekcji, przy czym w wątrobie obserwuje się większy krotny wzrost liczby leukocytów wątrobowych, ale znacznie mniejszą liczbę całkowitą w porównaniu do wzrostu liczby splenocytów w śledzionie. Typ i liczba komórek odpornościowych mogą zostać określone poprzez znakowanie zawiesin jednokomórkowych przeciwciałami specyficznymi dla markerów powierzchni komórkowych. Znakowane komórki można następnie wykryć za pomocą analizy FACS. Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne wyniki dla limfocytów T CD8+. Podczas standardowej infekcji Listeria u myszy C57BL/6 liczba limfocytów T CD8+ przejściowo spada z powodu limfopenii w śledzionie w dniach 2-3, a następnie wyraźnie rośnie od 5. dnia po infekcji zarówno w śledzionie, jak i w wątrobie.

Kultura bakteryjna na płytce agarowej; eksperyment z zakresu mikrobiologii; analiza wzrostu kolonii.
Rycina 1. Płytka HBA z posiewem Listeria. Do wykonania posiewu Listeria z mrożonego stoku glicerolowego użyto sterylnej pętlą do szczepień. Płytkę inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Charakterystyczna otoczka wokół pojedynczych kolonii wynika z β-hemolizy.

Porównanie wzrostu bakterii na płytkach z agarem, wyniki eksperymentu pokazujące różnice w koloniach w trzech próbkach.
Rycina 2. Homogenat tkanki z myszy zakażonej Listeria hodowany na płytkach HBA. Wątrobę pobrano z myszy C57BL/6 zakażonej Listeria 3 dni po zakażeniu. Przygotowano homogenat tkanki, a następnie naniesiono rozcieńczenia metodą posiewu powierzchniowego (100 μl na całą płytkę) dla rozcieńczenia 10-4 (A) i rozcieńczenia 10-5 (B), a także naniesiono krople po 25 μl na płytkę HBA dla każdego rozcieńczenia 1:10, od nierozcieńczonego do 10-5 (C). Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Rozcieńczenia umożliwiające przeliczenie pojedynczych kolonii służą do określenia ładunku bakteryjnego (tj. CFU/tkankę) w tym punkcie czasowym po zakażeniu.

Analiza wzrostu bakterii, JCF Listeria, śledziona/wątroba, dni po infekcji, wykres rozrzutu, dane po infekcji.
Rycina 3. Listeria w śledzionie i wątrobie zainfekowanych myszy C57BL/6 w 3. i 7. dobie po infekcji. Myszy C57BL/6 zainfekowano ~2,000 CFU Listeria. W każdym punkcie czasowym myszy poddano eutanazji, przepłukano wątrobę, a następnie pobrano ją wraz ze śledzioną; rozcieńczenia homogenatu śledziony (A) lub zawiesiny pojedynczych komórek wątroby (B) wysiano na płytki HBA w celu oznaczenia miana bakterii. Linie ciągłe oznaczają średnią geometryczną, a słupki pionowe błąd standardowy średniej (SEM). Linia przerywana wskazuje, że granica wykrywalności dla dokładnego pomiaru miana bakterii w tym eksperymencie wynosi 100 CFU/organ.

Analiza żywotności komórek z użyciem hemocytometru i wykresy kropkowe liczby żywych komórek w śledzionie i wątrobie.
Rysunek 4. Liczba żywych komórek w tkankach myszy zakażonych. Myszy C57BL/6 zakażono ~2,000 CFU Listeria. W każdym punkcie czasowym myszy uśpiono, a wątrobę przepłukano i pobrano wraz ze śledzioną. Komórki barwiono błękitem trypanu i liczono za pomocą hemocytometru zgodnie z opisem w kroku 5.9 (A). Liczba splenocytów (B) i leukocytów wątrobowych (C) uzyskana z zawiesin pojedynczych komórek przygotowanych z myszy zakażonych Listeria. Linie wskazują średnią geometryczną.

Cytometria przepływowa limfocytów T CD8; wykres TCRβ, PE-Cy7 oraz wykresy liczebności w śledzionie i wątrobie po infekcji.
Rysunek 5. Analiza FACS limfocytów T CD8+ u myszy zainfekowanych Listeria. Myszy C57BL/6 zainfekowano ~2 000 CFU Listeria. W każdym punkcie czasowym myszy uśpiono, przepłukano wątrobę i pobrano ją wraz ze śledzioną. Zawiesiny pojedynczych komórek barwiono przeciwciałami specyficznymi dla limfocytów T (CD3, TCRβ, CD4, CD8). (A) Reprezentatywne profile FACS z wartościami % limfocytów T CD8+ +/- SEM. (B) Całkowita liczba limfocytów T CD8+ w śledzionie. (C) Całkowita liczba limfocytów T CD8+ w wątrobie.

Dyskusja

Listeria jest jednym z najczęściej wykorzystywanych organizmów do charakteryzacji odpowiedzi odpornościowych gospodarza na bakterie wewnątrzkomórkowe6. Przedstawiony tutaj protokół umożliwia pomiar ładunku bakteryjnego oraz odpowiedzi komórek odpornościowych w obrębie tej samej tkanki u danej myszy. Taki podwójny pomiar w konkretnej tkance dla każdej zainfekowanej myszy pozwala na bardziej wiarygodne porównania w obrębie i pomiędzy kohortami myszy (reprezentującymi różne szczepy myszy lub punkty czasowe po infekcji). Choć do badania odpowiedzi odpornościowych u myszy można by wykorzystać infekcję Listeria drogą doustną, często stosuje się wstrzyknięcia dożylne, ponieważ: 1) zapewnia to szybkie i skuteczne dostarczenie patogenu do krwiobiegu; 2) skutkuje to zsynchronizowaną i spójną infekcją systemową; oraz 3) gatunek Mus posiada mutację w genie kodującym receptor E-kadheryna, co ogranicza infekcję Listeria drogą doustną (mutacja ta wpływa na zdolność Listeria do wiązania się z mysim receptorem E-kadheryny i do efektywnego pokonywania nabłonka przewodu pokarmowego)16-18.

W niniejszym protokole istnieje kilka krytycznych etapów. Po pierwsze, zapas inokulum Listeria należy przygotować ze świeżej, hodowanej przez noc kultury na agarze krwi konika (HBA), aby zapewnić żywotność i wirulencję. Po drugie, ważne jest dokładne określenie stężenia CFU inokulum przed i po wstrzyknięciu wszystkim myszom, aby upewnić się, że stężenie CFU nie różni się znacząco pomiędzy pierwszą a ostatnią wstrzykniętą myszą. Po trzecie, wstrzykiwanie Listeria do żyły ogonowej musi być wykonywane w sposób spójny dla wszystkich myszy. Na koniec konieczne jest przeprowadzenie perfuzji wątroby w celu usunięcia leukocytów nierezydentnych, co zapewni dokładny pomiar komórek odpornościowych wewnątrz wątroby, a nie leukocytów przepływających w krwi obwodowej. Niezastosowanie się do któregokolwiek z tych kroków może skutkować niepożądaną zmiennością obciążenia bakteryjnego i/lub odpowiedzi odpornościowych pomiędzy poszczególnymi myszami zakażonymi Listeria.

Dwie ograniczenia tego protokołu to umiejętności badacza w zakresie zakażania myszy poprzez wstrzyknięcie dożylne oraz wykrywanie ładunku bakteryjnego w tkankach. Jeśli jedna osoba wstrzykuje preparat dużej liczbie myszy, żywotność Listeria (tj. stężenie CFU) może z czasem spaść po rozmrożeniu mrożonego inokulum (np. >2 godziny między zakażeniem pierwszej a ostatniej myszy). Badacz musi samodzielnie określić, ile myszy jest w stanie zakażyć, zanim inokulum ulegnie pogorszeniu. Kolejnym ograniczeniem tej metody jest fakt, że ładunek Listeria nie może być dokładnie zmierzony poniżej 100CFU/organ z powodu stosunkowo niewielkich ilości hodowanego homogenatu tkankowego (np. Rysunek 3 wskazuje, że 100CFU/organ jest granicą detekcji). Aby dokładniej zmierzyć niższe wartości CFU/organ, można wyhodować większą ilość homogenatu tkankowego (do 0,5mL na płytkę, można użyć wielu płytek), tak aby do detekcji Listeria pobrano większą część tkanki. Jeśli Stomacher nie jest dostępny, w krokach 7.1-7.2 można zamiast niego zastosować alternatywne metody homogenizacji tkanki, takie jak użycie homogenizatora tkankowego. W kwestiach praktycznych, jeśli miejsce w inkubatorze 37°C do hodowli próbek tkanek z zakażonych myszy jest ograniczone, płytki z kulturą HBA można inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni (kolonie będą rosnąć wolniej w temperaturze pokojowej). Jednak temperatury pokojowej nie należy stosować podczas hodowli kultur do przygotowania mrożonych zapasów Listeria.

Niniejszy protokół przedstawia podstawowe podejście do charakterystyki zakażenia Listeria u myszy i może być stosowany w przypadku innych szczepów Listeria poza EGD. Oprócz wątroby i śledziony można również przygotować zawiesiny pojedynczych komórek z węzłów chłonnych. W obu przypadkach zawiesiny pojedynczych komórek mogą być wykorzystane do różnorodnych analiz, w tym do pomiaru subpopulacji komórek odpornościowych oraz stymulacji in vitro posortowanych komórek odpornościowych. Po opanowaniu podstawowych technik protokół ten można zmodyfikować w celu izolacji limfocytów T specyficznych dla Listeria19, charakterystyki komórek dendrytycznych20 lub przeprowadzenia deplekcji komórek odpornościowych w określonych punktach czasowych po zakażeniu21,22, aby dokładniej scharakteryzować odpowiedź immunologiczną u myszy zakażonych Listeria.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Annie Walduck, Christinie Cheers, Stuartowi Berzinsowi, Dale'owi Godfreyowi, Yifan Zhan i Jonathanowi Wilkschowi za rady oraz odczynniki. Niniejsza praca była finansowana przez Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) oraz Australijną Krajową Radę Badawczą w dziedzinie Zdrowia i Medycyny (575552). NW otrzymuje wsparcie w ramach Australian Postgraduate Award. OW otrzymuje wsparcie z fellowship R.D. Wright przyznanego przez Australijną Krajową Radę Badawczą w dziedzinie Zdrowia i Medycyny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podłoże agarowe z krwią konia nr 2Oxford LabwareCM0271Przygotowanie podłoża agarowego dla płytek HBA
Krew konia (defibrynowana)Oxford LabwareHB1000Dodać 5-10% do podłoża agarowego
Bulion Brain Heart Infusion (BHI) (10 mL)Oxford LabwareTM456
Odżywka Brain Heart Infusion w proszkuOxford LabwareCM1135
Płytka 96-dołkowa z płaskim dnemBD Biosciences353072
Sito do komórek 70 μmBD Biosciences352350
Mała szalka PetriegoBD Biosciences351007
System laboratoryjny Stomacher 80 biomasterSeward
Plastikowe worki do StomacheraSarstedt Ltd86 9924 530
Seryjne albuminy wołoweSigma-AldrichA3912
Bufor FACS0,1% (w/v) seryjnych albumin wołowych w PBS
Izotoniczny Percoll (33,75% Percoll w PBS)GE Healthcare17-0891-0133,75mL Percoll, 3,75mL 10x PBS, 62,5mL 1x PBS daje 100mL izotonicznego Percollu
Bufor TAC17mM Tris, 140mM chlorku amonu w wodzie destylowanej
Bufor FCS/EDTAPłydka surowica cielęca z 10mM EDTA
Bufor FACS/EDTABufor FACS + 5mM EDTA
Błękit trypanuSigma-AldrichT61460,4% (w/v) w PBS, sterylizowany przez filtr
Krioprobetka 2mLGreiner Bio-One121263
Strzykawka insulinowa 27G/1mLTerumo Medical Corp.SS10M2713
IgłaTerumo Medical Corp.NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)
StrzykawkaTerumo Medical Corp.SS-01T (1mL), SS-053 (5mL), SS-10S (10mL)

Bibliografia

  1. Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: clinical and experimental update. J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).
  2. Conlan, J. W. Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview. Immunobiology. 201, 178-187 (1999).
  3. Neuenhahn, M., Busch, D. H. Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens. Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).
  4. Cousens, L. P., Wing, E. J. Innate defenses in the liver during Listeria infection. Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).
  5. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  6. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).
  7. Cheers, C., McKenzie, I. F. Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis. Infect Immun. 19, 755-762 (1978).
  8. Garifulin, O., Boyartchuk, V. Listeria monocytogenes as a probe of immune function. Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).
  9. Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus. J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).
  10. Gervais, F., Desforges, C., Skamene, E. The C5-sufficient A/J congenic mouse strain. Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes. J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).
  11. Boyartchuk, V. L. Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice. Nat Genet. 27, 259-260 (2001).
  12. Boyartchuk, V. The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice. J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).
  13. Pan, H. Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis. Nature. 434, 767-772 (2005).
  14. Garifulin, O. Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection. PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).
  15. Hof, H. Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a. Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).
  16. Wollert, T. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
  17. Lecuit, M. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
  18. Marco, A. J. Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route. Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).
  19. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes. Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).
  20. Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. DCs in mouse models of intracellular bacterial infection. Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).
  21. Conlan, J. W., North, R. J. Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody. J Exp Med. 179, 259-268 (1994).
  22. Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice. Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar obci enia bakteryjnegozaka enie Listeriamodel mysiliczenie CFUzawiesina pojedynczych kom rekanaliza FACSperfuzja w trobypobieranie ledzionyanaliza odpowiedzi immunologicznejjednostki tworz ce kolonie
Pomiar ładunku bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznych u myszy zainfekowanych Listeria monocytogenes
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.