Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Przygotowanie testu
- Zbierz, przygotuj i uporządkuj materiały przeznaczone do zabiegu (patrz Tabela Konkretnych Materiałów/Sprzętu).
- Oznacz probówki 12 x 75 mm.
- Oznacz dwie probówki dla każdego uczestnika: jedną probówkę do testu fagocytozy (oznacz tę probówkę czarnym tuszem i "F" dla izotiocyjanianu fluoresceiny [FITC]) i jedną probówkę do testu aktywności wybuchu oksydacyjnego (OB) (oznacz tę probówkę czerwonym tuszem i "H" dla dihydroetydydy [HE]).
nuta: Zaleca się stosowanie sterylnych probówek o wymiarach 12 x 75 mm w celu zminimalizowania niezamierzonej aktywacji komórkowej i związanego z tym wzrostu hałasu tła.
- Oznacz trzy probówki do testów kontrolnych: jedną probówkę do testu fagocytozy (kontrola FITC: oznacz tę probówkę czarnym tuszem i literą "F"), jedną probówkę do testu aktywności OB (kontrola HE: oznacz tę probówkę czerwonym atramentem i "H") i jedną probówkę do kontroli ujemnej (tylko krew: oznacz tę probówkę zielonym atramentem i "tylko krew").
- Przygotować roztwory podstawowe co najmniej jeden dzień przed dniem próby.
- Przygotować sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS). Rozcieńczyć 100 ml 10x PBS 900 ml 18,2 MΩH2O. Filtr sterylizować filtrem 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Przygotuj sterylną glukozę PBS. Rozpuścić 1,0 g glukozy w 100 ml PBS. Filtr sterylizować filtrem 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Przygotować sterylny 0,1 M bufor cytrynianu. Rozpuścić 1,2 g kwasu cytrynowego i 1,1 g cytrynianu sodu w 100 ml 18,2 MΩH2O. Doprowadzić pH do 4,0. Filtr sterylizować filtrem 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Przygotować roztwór podstawowy HE. Zawiesić 1,0 mg HE w 1,0 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Delikatnie wymieszać, porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
- Przygotować roztwór podstawowy Staphylococcus aureus (S. aureus) znakowany metodą FITC (2 x 10 9 cząstek/ml). Zawiesić 10 mg S. aureus znakowanego FITC w 1,5 ml (lub odpowiedniej ilości) PBS. Podzielić na trzy podwielokrotności po 500 μl i poddać sonizacji zgodnie z zaleceniami producenta. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
- Przygotować nieznakowany roztwór podstawowy S. aureus (2 x 10 9 cząstek/ml). Zawiesić 100 mg nieznakowanego S. aureus w 15 ml (lub odpowiedniej ilości) PBS. Podzielić na trzydzieści 500 μl podwielokrotności i poddać sonikacji zgodnie z zaleceniami producenta. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
- Przygotować świeże roztwory robocze w dniu próby.
- Przygotować roztwór roboczy dla programu "Horyzont Sześć". Przenieść 10 μl rozmrożonego roztworu podstawowego HE do 990 μl PBS-glukozy. Chronić przed światłem i przechowywać na lodzie do czasu użycia.
- Przygotować roztwór roboczy S. aureus znakowany znakiem FITC (133,333 cząstki/μl). Przenieść 70 μl rozmrożonego roztworu podstawowego S. aureus znakowanego FITC do 980 μl PBS. Chronić przed światłem i przechowywać na lodzie do czasu użycia.
- Przygotować nieznakowany roztwór roboczy S. aureus (133,333 cząstki/μl). Przenieść 70 μl rozmrożonego, nieznakowanego roztworu podstawowego S. aureus do 980 μl PBS. Chronić przed światłem i przechowywać na lodzie do czasu użycia.
- Przygotuj roztwór hartowniczy. Dodać 750 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego do 11,25 ml sterylnego 0,1 M buforu cytrynianowego. Przechowywać w lodowatej kąpieli wodnej do czasu użycia.
- Zleć certyfikowanemu flebotomiście pobranie krwi zgodnie z wytycznymi Światowej Organizacji Zdrowia dotyczącymi pobierania krwi.
- Pobrać krew do jednej probówki o pojemności 4 ml zawierającej kwas dipotasowy, etylenodiaminotetraoctowy (K2EDTA). Odwróć probówkę do pobierania krwi zgodnie z instrukcjami producenta. Trzymaj probówkę do pobierania krwi w temperaturze pokojowej na bujaku stołowym do czasu użycia. Krwi tej należy użyć do pełnej morfologii krwi (CBC) z analizą różnicową białych krwinek (WBC) opisaną w kroku 1.2.1.
- Pobrać krew do jednej probówki o pojemności 4 ml zawierającej heparynę litową. Odwróć probówkę do pobierania krwi zgodnie z instrukcjami producenta. Trzymaj probówkę do pobierania krwi w temperaturze pokojowej (RT) na bujaku stołowym do czasu użycia. Użyj tej krwi do fagocytozy monocytów i granulocytów oraz testu aktywności OB opisanego w kroku 2.
- Określić ilość bakterii (tj. S. aureus), która będzie potrzebna do wykonania testu dla każdej próbki.
- Użyj analizatora hematologicznego, aby wykonać morfologię krwi z analizą różnicową WBC we krwi, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Zanotuj liczbę krwinek białych (w komórkach/ml), % neutrofili i %monocytów.
- Skorzystaj z poniższych równań, aby określić liczbę neutrofili i monocytów dla każdej próbki.
Liczba neutrofili (w komórkach/ml) = %neutrofile × WBC (w komórkach/ml)
Liczba monocytów (w komórkach/ml) = %Monocyte × WBC (w komórkach/ml)
- Skorzystaj z poniższych równań, aby określić liczbę fagocytów dla każdej próbki oraz liczbę fagocytów obecnych w 100 μl próbki.
Liczba fagocytów (w komórkach/ml) = liczba neutrofili (w komórkach/ml) + liczba monocytów (w komórkach/ml)
Liczba fagocytów w 100 μl = (liczba fagocytów (w komórkach/ml))/10
- Użyj poniższego równania, aby określić liczbę bakterii (tj. S. aureus) potrzebnych do każdej próbki oraz ilość znakowanego FITC roztworu roboczego S. aureus lub nieznakowanego S. aureus (133,333 cząstek/ml), które należy dodać do każdej probówki.
nuta: Stosunek bakterii docelowych do fagocytów wynosi 8:1,
Liczba potrzebnych bakterii = Liczba fagocytów w 100 μl × 8
Potrzebna objętość FITC lub nieznakowanego roztworu roboczego (w μl) = (liczba potrzebnych bakterii)/(133,333 cząstki/μl)
2. Wykonaj test
- Przygotuj krew pełną do testu.
- Dla każdego uczestnika i probówki kontrolnej użyj przedłużonej końcówki pipety, aby przenieść 100 μl krwi pełnej z probówki do pobierania krwi z heparyną litową na dno odpowiednio oznakowanej probówki o wymiarach 12 x 75 mm. Wymień caps.
nuta: Uważaj, aby nie dostać się krwi na boki rurek 12 x 75 mm.
- Za pomocą mikropipety dodać 10 μl roztworu roboczego HE do probówek oznaczonych czerwonym tuszem i literą "H", w tym do probówki kontrolnej HE. Załóż nasadki i krótko wiruj.
- Inkubować wszystkie probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Następnie natychmiast przenieś wszystkie probówki do łaźni lodowatej na 12 minut.
nuta: Użyj otwartego metalowego stojaka i delikatnie potrząsaj stojakiem co 5 minut, aby upewnić się, że rurki są szybko i odpowiednio ogrzane lub schłodzone.
- Dodać bakterie (tj. S. aureus) do próbki i probówek kontrolnych.
- Za pomocą mikropipety dodać odpowiednią ilość (obliczoną w kroku 1.2.4) nieznakowanego roztworu roboczego S. aureus do probówek oznaczonych czerwonym tuszem i literą "H", w tym probówki kontrolnej HE. Załóż nasadki i krótko wiruj.
- Za pomocą mikropipety dodać odpowiednią ilość (obliczoną w kroku 1.2.4) roztworu roboczego S. aureus znakowanego FITC do probówek oznaczonych czarnym tuszem i literą "F", w tym probówki kontrolnej FITC. Załóż nasadki i krótko wiruj.
- Wirować probówkę kontrolną "tylko krew", ale nie dodawać do niej żadnego rodzaju bakterii (np. S. aureus).
- Inkubować wszystkie probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut. Używać otwartego metalowego stojaka i delikatnie potrząsać stojakiem co 5 minut, aby upewnić się, że probówki są szybko i odpowiednio ogrzane. Po okresie inkubacji natychmiast przenieść wszystkie probówki do łaźni lodowatej na 1 minutę.
- Umyj komórki.
- Za pomocą pipety powtarzalnej dodaj 100 μl lodowatego roztworu hartowniczego do wszystkich probówek. Załóż nakrętki, krótko zwiruj, a następnie inkubuj wszystkie probówki na lodzie przez 1 minutę.
- Za pomocą pipety powtarzalnej dodać 1 ml lodowatego PBS do wszystkich probówek. Krótko zmieszaj, a następnie dodaj dodatkowe 2 ml lodowatego PBS do wszystkich probówek i załóż nakrętki. Odwirować wszystkie probówki przez 5 minut w temperaturze 4 °C i 270 x g, a następnie odessać supernatant.
- Powtórz krok 2.3.2 jeden raz (w sumie 2 prania).
- Przygotować próbki do cytometrii przepływowej.
- Za pomocą pipety powtarzalnej dodaj 50 μl lodowatej płodowej surowicy bydlęcej do wszystkich probówek. Krótko przekręć wszystkie rurki.
- Przenieś wszystkie probówki do odpowiedniej karuzeli i użyj zautomatyzowanej stacji roboczej do przygotowywania lizy komórek z odczynnikami do lizy czerwonych krwinek (RBC) i utrwalania krwinek białych w celu lizy krwinek czerwonych i utrwalenia krwinek białych zgodnie z opisem w instrukcjach producenta.
