Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Konfiguracja eksperymentalna
- Stosować arkusze bibuły filtracyjnej (włókniste arkusze hydroksylowanego poliestru, patrz Tabela materiałów).
- Wytnij paski o wymiarach 3 x 15 mm dla 1-miesięcznego dziecka i w kształcie litery L dla starszych dzieci i dorosłych (5 x 20 x 10 mm (krótkie ramię L)).
- Włóż jeden kawałek bibuły filtracyjnej do każdego nozdrza niemowlęcia za pomocą kleszczy. Umieść bibułę filtracyjną w przedniej części małżowiny usznej dolnej (około 1 cm wewnątrz nozdrza dla noworodków i 1,5 cm dla wszystkich innych grup wiekowych).
- Umieść noworodki na łóżku i daj im wodę z cukrem dla wygody.
nuta: W przypadku dzieci w każdym innym wieku pobieranie próbek jest najłatwiejsze do wykonania, gdy badany siedzi na krześle.
- W przypadku starszych dzieci włóż długie ramię bibuły filtracyjnej w kształcie litery L do każdego nozdrza.
- Zastosuj klips na nos wokół nozdrzy, aby zminimalizować dyskomfort i uniknąć przypadkowej utraty bibuły filtracyjnej.
- Usuń bibuły filtracyjne po 2 minutach wchłaniania.
- Umieścić bibuły filtracyjne w oznakowanych probówkach i natychmiast zamrozić je w temperaturze -80 °C.
- Należy zanotować wszelkie objawy infekcji dróg oddechowych wykazywane przez dziecko w dniu pobrania próbki.
- Zapisz każde kichanie, uporczywy płacz lub krwawienie z nosa, które wystąpi w ciągu 2 minut pobierania próbek.
2. Kwantyfikacja mediatorów immunologicznych dróg oddechowych
- Pobranie do 10 losowych próbek z zamrażarki. Zapisz numery identyfikacyjne. Próbki należy przechowywać na lodzie przez cały czas trwania procesu roboczego.
- Po rozmrożeniu na lodzie zanurzyć bibuły filtracyjne (na badanego) z obu nozdrzy w 300 μl świeżo przygotowanego buforu (patrz Tabela Materiałów) zawierającego jedną kompletną tabletkę inhibitora proteazy (patrz Tabela Materiałów) na 25 ml buforu.
- Dostosuj objętość bufora zgodnie z rozmiarem bibuły filtracyjnej.
- Do bibuł filtracyjnych o wymiarach 3 x 15 mm należy użyć 300 μl buforu.
- Jeśli dostępna jest tylko jedna bibuła filtracyjna, należy użyć połowy objętości bufora (150 μl).
- Przenieść próbki do wytrząsarki płytkowej (400 obr./min) na 5 minut. Użyć timera.
- Przenieść wilgotną bibułę filtracyjną i bufor do oznaczania do kubka filtra z rurki z octanu celulozy (wielkość porów 0,22 μm) umieszczonego w probówce do mikrowirówki (patrz tabela materiałów).
- Wirować przy 16 000 x g przez 5 minut w schłodzonej wirówce (w temperaturze 4 °C) w celu uzyskania przefiltrowanego ekstraktu z nosa w probówce.
- Wyjąć kubek i trzymać probówki na lodzie, jednocześnie dodając ekstrakt z nosa do dołków płytek spichrzających o niskiej zawartości białka wiążącej (patrz Tabela Materiałów).
- Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
- Określić stężenia cytokin i chemokin w ekstraktach donosowych za pomocą wysoce czułego, opartego na elektrochemiluminescencji systemu multipleksowanych matryc (patrz tabela materiałów).
c: Przeprowadzono tu ludzki test cytokin 10-plex TH1/TH2, test chemokiny 9-plex oraz interleukinę-17A z pojedynczą pleksem (IL-17A), transformujący czynnik wzrostu-beta1 (TGF-β1) i limfopoetynę zrębu grasicy (TSLP).
- W przypadku testów należy inkubować ekstrakty z nosa przez noc w temperaturze 4 °C. Pomiary należy przeprowadzić zgodnie ze standardowym protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
nuta: Testy immunologiczne (patrz Tabela materiałów) zazwyczaj mają wysoki zakres dynamiki pomiaru w zakresie od 1 do 10 000 pg/ml, ale w przypadku niektórych testów może to być 100 000 pg/ml. Oznacza to, że wszystkie próbki mogą być badane w tym samym rozcieńczeniu, co ogranicza wpływ różnych rozcieńczeń u osób zdrowych i chorych, jak ma to miejsce w przypadku innych podobnych testów immunologicznych. Dolna granica wykrywalności dla wszystkich cytokin wynosiła 1 pg/ml lub mniej, a dla chemokin wahała się od 1 do 50 pg/ml. TSLP nie był wykrywalny w 98% próbek w wieku 1 miesiąca.
