$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Projektowanie i przygotowanie peptydów
- Uzyskaj sekwencję białka fuzyjnego, które Cię interesuje, z publicznej bazy danych, takiej jak NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) lub bazy danych patogenów wirusowych (https://www.viprbrc.org). Wybierz miejsce rozpoznawania proteazy poprzedzające peptyd fuzyjny i uwzględnij 2-3 aminokwasy przed i za tą sekwencją.
- Zamawiając peptydy, zmodyfikuj je za pomocą pary FRET 7-metoksykumaryno-4-ylu acetylu (MCA) na N-końcu i N-2,4-dinitrofenylu (DNP) na C-końcu.
nuta: Kilku dostawców zapewnia te modyfikacje. Cena i czas dostawy zależą od wybranego dostawcy. Istnieją jednak alternatywne modyfikacje, które różnią się czułością i wymagają dostosowania czytnika płytek pod względem długości fal.
- Zawiesić peptyd zgodnie z zaleceniami producenta, delikatnie pipetując go w górę iw dół. Na przykład ponownie zawiesić peptydy w 70% etanolu do końcowego stężenia 1 mM.
- Opcjonalnie dodać probówkę zawierającą peptyd i rozpuszczalnik do kąpieli sonicyjnej, aż do całkowitego ponownego zawieszenia, jeśli peptyd nie ulega zbyt dobremu zawieszeniu przez pipetowanie.
- Porcjować peptyd do probówek tłumiących światło lub odpornych na światło, aby chronić peptyd przed bieleniem. Utrzymuj małe rozmiary porcji, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania (np. 100 μL). Porcje należy przechowywać w temperaturze -20°C.
2. Przygotowanie czytnika płytek fluorescencyjnych
- Włącz czytnik płytek i poczekaj, aż autotest zostanie zakończony.
- Otwórz oprogramowanie operacyjne na podłączonym komputerze i upewnij się, że jest ono podłączone do czytnika płytek.
- Otwórz ustawienie temperatury i ustaw ją na 30 °C (lub temperaturę wymaganą do optymalnej wydajności proteazy).
- Kliknij Kontrola | Konfiguracja instrumentu, aby skonfigurować eksperyment.
- Wybierz opcję Kinetyczny.
- Wybierz opcję Fluorescencja.
- Wprowadź długości fal wzbudzenia i emisji: odpowiednio 330 nm i 390 nm.
- Usuń zaznaczenie opcji Automatyczne wyłączanie.
- Wybierz opcję Średnia, normalna czułość.
- Wybierz czas trwania testu wynoszący 1 godzinę i wybierz jeden pomiar co 60 sekund.
- Ustaw mieszanie 5 s przed pierwszym pomiarem i 3 sekundy przed każdym pomiarem
- Wybierz studzienki do odczytania i rozpocznij test.
3. Przygotowanie testu
- Przygotować bufor do oznaczania, obliczając odpowiednie ilości dla każdego składnika i dodając go. W przypadku furyny należy wykonać bufor składający się ze 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-merkaptoetanolu i 5% Triton X-100. W przypadku trypsyny należy użyć standardowego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
nuta: Objętości 10 ml lub mniejsze są wystarczające. W zależności od proteazy (proteaz) użytej w teście bufor jest różny.
- Schłodzić bufor na lodzie.
- Umieść płytkę testową na lodzie z cienką metalową płytką pod spodem, aby wspomóc chłodzenie i stabilność. Użyj solidnej czarnej polistyrenowej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem i niepoddanej obróbce.
nuta: Konieczne jest stosowanie czarnych płytek, aby zapobiec fluorescencyjnemu "wyciekowi" z sąsiednich studzienek.
- Oblicz odpowiednią ilość proteazy do dodania dla każdej reakcji na podstawie wcześniejszych publikacji lub danych eksperymentalnych. W przypadku furyny należy użyć 1 jednostki na reakcję, co odpowiada 0,5 μl. W przypadku trypsyny użyj 0,5 μl trypsyny TPCK o stężeniu 160 nM.
- Na próbkę należy przygotować 3 kontrpróby techniczne na test o łącznej objętości 100 μl na próbkę.
nuta: Eksperymentalnie oceniono, że nie ma znaczenia, czy pipetowanie odbywa się w normalnych warunkach oświetleniowych, czy w przyciemnionym świetle. Jednak peptydy nie powinny być wystawione na działanie światła przez dłuższy czas.
- Odpipetować odpowiednią ilość buforu do oznaczania (94,5 μl, zgodnie z opisem w kroku 3.1) do każdego dołka.
- Dodaj proteazę do każdej studzienki. Zarówno w przypadku furyny, jak i trypsyny TPCK, należy użyć 0,5 μl na próbkę. Do 6 dołków (3 dołki dla ślepej próby i 3 dołki dla kontroli peptydowej) dodaj 0,5 μl buforu zamiast odpowiedniej proteazy.
- Dodać peptyd do końcowego stężenia 50 μM w każdym studzience z wyjątkiem ślepej próby. W tym przypadku pipetę 5 μl peptydu przygotowano zgodnie z opisem w kroku 1.3. Dodać 5 μl buforu do ślepej próby kontrolnej zamiast peptydu.
nuta: Początkowo przetestowano kilka stężeń peptydu z opisanymi stężeniami enzymów, aby upewnić się, że enzymy są nasycone.
- Włóż płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych i kliknij przycisk start.