Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych w celu zbadania aktywności proteolitycznej proteaz

Abstract

Źródło: Jaimes, J. A., et al. A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen, Detection: Tests for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje test do badania proteolitycznego aktywności proteaz za pomocą peptydów fluorogennych. Proteaza rozpoznaje miejsce jego rozszczepienia na peptydzie, rozszczepiając go i oddzielając wygaszacz od fluoroforu, umożliwiając jego emisję fluorescencyjną. Sygnał fluorescencyjny jest wykrywany i analizowany w celu sprawdzenia wydajności rozszczepienia różnych wariantów peptydów.

Protocol

1. Projektowanie i przygotowanie peptydów

1. Uzyskaj sekwencję białka fuzyjnego, które Cię interesuje, z publicznej bazy danych, takiej jak NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) lub bazy danych patogenów wirusowych (https://www.viprbrc.org). Wybierz miejsce rozpoznawania proteazy poprzedzające peptyd fuzyjny i uwzględnij 2-3 aminokwasy przed i za tą sekwencją.
2. Zamawiając peptydy, zmodyfikuj je za pomocą pary FRET 7-metoksykumaryno-4-ylu acetylu (MCA) na N-końcu i N-2,4-dinitrofenylu (DNP) na C-końcu.
   nuta: Kilku dostawców zapewnia te modyfikacje. Cena i czas dostawy zależą od wybranego dostawcy. Istnieją jedna....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
peptydy	Biomatik	N/a
Furin (Furin)	Neb	Zobacz materiał P8077S
Trypsyna poddana działaniu TPCK	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 4352157-1KT
HEPESY	Sigma-Aldrich	H3375
CaCl2	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C1016
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M6250
Tryton-X100	Sigma-Aldrich	Silnik X100
Pbs	Corning	21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS	Urządzenia molekularne	Pliki XPS
SoftMax Pro 6.5.1	Urządzenia molekularne	N/a
Płytka 96-dołkowa (solidny polistyren z płaskim dnem i nieobrobiony)	Costar	Numer katalogowy: 3915
Rurki tłumiące światło	Laboratorium Watsona	131-915BL lub 131-915BR