Monitorowanie przybycia białek powierzchniowych znakowanych GFP do sieci trans-Golgiego przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał

Streszczenie

Źródło: Buser, D. P., et al. Analiza wychwytu endocytarnego i transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje metodę badania absorpcji i transportu wstecznego funkcjonalizowanych nanociał w celu zrozumienia ich wewnątrzkomórkowych szlaków transportowych. Dzięki wprowadzeniu znakowanego radioaktywnie siarczanu oraz wykorzystaniu technik izolacji i wykrywania, metoda ta umożliwia badanie wychwytu endocytarnego i docierania białek ładunkowych do sieci trans-Golgiego.

Protokół

1. Absorpcja funkcjonalizowanych nanociał przez hodowane komórki (do analizy zasiarczenia)

1. W kapturze do hodowli komórkowej nasiona ~ 400 000 do 500 000 komórek HeLa stabilnie wyrażających białko reporterowe znakowane GFP na szalkach 35 mm lub na 6-dołkowych klastrach z kompletną pożywką zawierającą antybiotyki (zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Modified Eagle, DMEM, uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 100 jednostek/ml streptomycyny, 2 mM l-glutaminy i 1,5 μg / ml puromycyny).
   nuta: Jak wspomniano powyżej, używamy tutaj komórek HeLa stabilnie eksprymujących EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR i TfR-EGFP w celach ilustracyjnych. Oprócz stabilnych linii komórkowych można również stosować przejściowo transfekowaną HeLa.
2. Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 7,5% CO_{2 w} celu proliferacji.
   nuta: Następnego dnia komórki powinny mieć konfluencję ~80%.
3. Usunąć całą pożywkę, przemyć 2 razy 1x PBS w temperaturze pokojowej i zagłodzić komórki pożywką bezsiarczanową (SFM) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 7,5%_CO2.
   nuta: SFM przygotowuje się przez dodanie 10 ml roztworu aminokwasów MEM (50x), 5 ml L-glutaminy (200 mM), 5 ml roztworu witamin (100x) i 900 μL CaCl₂·2H₂O do 500 ml zrównoważonych soli Eagle's. Przepuścić przez filtr 0,22 μm i podwielokrotność.
4. W wentylowanym okapie lub na stole przeznaczonym do pracy radioaktywnej przygotować pożywkę do znakowania siarczanów zawierającą 0,5 mCi/ml [³⁵S] siarczanu w postaci soli sodowej w SFM.
   ostrożność: Ostrożnie obchodzić się ze wszystkimi roztworami zawierającymi radioaktywność. Pracuj tylko w wyznaczonych okapach lub ławkach. Wszystkie materiały (końcówki, rurki, płytki itp.) lub płuczące mające kontakt z radioaktywnością muszą być zbierane i utylizowane oddzielnie. Zrób to również dla wszystkich poniższych kroków (kroki 1.5-1.18).
5. Dodać VHH-2xTS w 1x PBS do pożywki do znakowania siarczanów do końcowego stężenia 2 μg/mL.
   nuta: Jako kontrolę, należy również uwzględnić VHH-std lub inną nanobody pozbawioną miejsc TS, aby zademonstrować specyficzne oznakowanie.
6. Zastąp SFM 0,7 ml pożywki do znakowania siarczanów zawierającej 0,5 mCi/ml siarczanu [35S] i 2 μg/ml VHH-2xTS i inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o sile 7,5% CO₂ przeznaczonym do pracy z radioaktywnością.
   nuta: W zależności od planowanego eksperymentu należy dostosować czas zasiarczenia nanocząsteczki. Ponadto, aby określić kinetykę przybycia TGN, etykietowanie przeprowadza się dla różnych czasów (np. dla 10 min, 20 min, 30 min itp.).
7. Usuń podłoże do etykietowania i umyj komórki 2-3 razy lodowatym 1x PBS na płycie chłodzącej lub lodzie.
8. Dodać 1 ml buforu do lizy (PBS zawierającego 1% Triton X-100 i 0,5% deoksycholanu) uzupełnionego 2 mM PMSF i 1x koktajlem inhibitorów proteazy i inkubować komórki przez 10-15 minut na platformie kołyszącej w temperaturze 4 °C.
9. Zeskrobać i przenieść lizat do probówki o pojemności 1,5 ml, zmieszać lizat i umieścić na 10-15 minut na rotatorze typu end-over-end w temperaturze 4 °C.
10. Przygotować lizat pojądrowy przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
11. Używając nowej probówki o pojemności 1,5 ml, przygotuj 20-30 μl zawiesiny kulek niklowych w probówce o pojemności 1,5 ml i przemyj raz 1x PBS, delikatnie granulując je w ilości 1,000 x g przez 1 min.
    nuta: Zamiast kulek niklowych można użyć kulek streptawidyny (jeśli nanocząsteczka jest biotynylowana) lub kulek białkowych A z IgG przeciwko epitopowi nanowirusa (znacznik T7 lub HA).
12. Przenieść lizat pojądrowy do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej kulki niklu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-over-end w celu wyizolowania nanociał. Usunąć podwielokrotność (50–100 μl) lizatu pojądrowego i zagotować w buforze próbki SDS w celu późniejszej analizy immunoblot całkowitego nanociała związanego z komórką, reportera GFP i kontroli obciążenia.
13. Umyj kulki 3 razy za pomocą 1x PBS lub buforu do lizy, delikatnie granulując w 1.000 x g przez 1 min.
    nuta: W celu bardziej rygorystycznego mycia kulek 20 mM imidazol może być zawarty w PBS lub buforze do lizy.
14. Ostrożnie usunąć cały bufor płuczący z kulek, dodać 50 μl buforu do 2 próbek i gotować przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
15. Załaduj oba ugotowane kulki na żel midi 12,5% SDS-PAGE i uruchom zgodnie ze standardowym protokołem PAGE, aż barwnik referencyjny (np. błękit bromofenolowy) dotrze do końca żelu separującego.
    nuta: Analizę immunoblot całkowitego nanociała związanego z komórką, reportera GFP i kontroli obciążenia można również przeprowadzić przy użyciu mini 12,5% SDS-PAGE lub prefabrykowanego żelu gradientowego.
16. Utrwalić żel separacyjny w ~30 ml buforu utrwalającego (10% kwasu octowego i 45% metanolu w ddH₂O) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, przemyć żel trzykrotnie ~50 ml wody dejonizowanej i przygotować do wyschnięcia żelu.
17. Suszenie żeli SDS-PAGE.​
    1. Ostrożnie umieść utrwalony żel na rozciągniętej folii spożywczej i przykryj go wstępnie przyciętą bibułą filtracyjną.
    2. Umieść żel bibułą filtracyjną w dół na platformie suszącej, załóż pokrywę próżniową i włącz pompę próżniową w celu suszenia żelu. Suszyć żel przez 3-5 godzin.
    3. Usuń folię spożywczą i umieść wysuszony żel w kasecie autoradiograficznej wyposażonej w ekran luminoforowy.
18. Autoradiogram obrazu za pomocą Phosphor Screen Imager. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    nuta: W zależności od siły sygnału, wysuszone żele muszą być dłużej naświetlane za pomocą ekranów luminoforowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-GFP	Sigma-Aldrich	1.18145E+11	Produkt jest dystrybuowany przez SigmaAldrich, ale produkowany przez Roche
Zmodyfikowany średni Eagle firmy Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich
Surowica cielęca płodu (FCS)	Biowest (Zachód Biologi
Siarka-35 jako siarczan sodu	Analityka Hartmann	ARS0105	Produkt zawiera 5 mCi
Płytki 6-dołkowe	TPP (TPP)	Numer katalogowy: 92406
Paraformaldehyd (PFA)	Aplikacja	Samolot A3813
Fluoromount-G	Południowa biotechnologia	Numer katalogowy: 0100-01
Żele Mini-Protean TGX, 4-20%, 15-dołkowe	Bio-Rad	456-1096