Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Hodowla pasożytów
UWAGA: Postępuj zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi postępowania z ludzkimi patogenami.
- Utrzymuj pasożyty Plasmodium falciparum zgodnie ze standardowym protokołem, jak opisano wcześniej w pożywce do hodowli pasożytów (patrz tabela materiałów).
- Utrzymuj pasożyty w ścisłej synchronizacji, stosując leczenie sorbitolem, jak opisano wcześniej.
- Aby zapewnić ekspresję VAR2CSA powierzchni erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum (IE), należy wykonać powtarzające się rundy selekcji immunologiczno-magnetycznej przy użyciu przeciwciała anty-VAR2CSA (np. Przeciwciała PAM1.4, reaktywnej krzyżowo ludzkiej monoklonalnej VAR2CSA specyficznej dla ) sprzężonej z kulkami magnetycznymi białka G.
- Krótko mówiąc, inkubuj późne stadium trofozoitów-IE za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem anty-VAR2CSA i pozytywnie wybierz za pomocą magnesu.
- Rozwijaj wybrane pasożyty w kulturze przez kilka cykli, aż parazytemia osiągnie co najmniej 5%.
- Alternatywnie, wybierz pasożyty, które wiążą się z unieruchomionym plastikiem CSA (receptorem dla VAR2CSA), jak opisano wcześniej.
- Aby zweryfikować VAR2CSA ekspresję na wybranych pasożytach, należy przeprowadzić cytometrię przepływową, jak opisano wcześniej.
- Krótko mówiąc, oznacz późne stadium trofozoitów-IE tym samym przeciwciałem, które jest używane do selekcji magnetycznej (krok 1.3), a następnie fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym.
- Zmierzyć reaktywność powierzchniową IE za pomocą cytometrii przepływowej. Udana selekcja przeciwciał zwykle prowadzi do powstania populacji pasożytów, która wykazuje ekspresję VAR2CSA u większości pasożytów (≈80%).
- Do testu fagocytozy należy użyć oczyszczonych trofozoitów-IE w średnim i późnym stadium. Przeprowadzić oczyszczanie za pomocą separacji magnetycznej, jak opisano wcześniej.
nuta: Aby dokładnie określić stadium pasożytów, należy wykonać barwienie metodą Giemsa na rozmazach krwi, a następnie obserwację pod mikroskopem świetlnym. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami i wytycznymi morfologicznymi, jak opisano powyżej. Oczyszczanie na późnym etapie można również przeprowadzić przy użyciu podłoża o gradiacji gęstości. Z naszego doświadczenia wynika, że wydajność IE jest jednak niższa, dlatego preferowane jest oczyszczanie magnetyczne.
- W celu separacji magnetycznej wiruj kulturę pasożytów (5-10% parazytemii) w temperaturze 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki do hodowli pasożytów.
- Dodaj zawiesinę pasożyta do kolumny CS Claricep Flash Silica, sprzężonej z magnesem (patrz Tabela materiałów) i pozwól jej powoli przejść przez kolumnę. Trophozoite-IE są paramagnetyczne (ze względu na obecność hemoozyny) i pozostaną w siatce kolumny.
- Przemyć kolumnę 50 ml pożywki do hodowli pasożytów i wymyć IE z kolumny magnetycznej za pomocą 50 ml pożywki do hodowli pasożytów.
- Wirować eluat z 1.5.3 przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić go w 1 ml pożywki do hodowli pasożytów.
- Za pomocą hemocytometru policz liczbę IE (łatwo zidentyfikowanych za pomocą mikroskopu świetlnego jako erytrocyty z ciemnym barwnikiem hemozozyiny) i całkowitą liczbę komórek, aby obliczyć końcową parazytemię (procent IE).
nuta: Używaj tylko pasożytów o czystości co najmniej 80% (80% IE).
- Na podstawie liczby próbek surowicy/przeciwciał planowanych do testowania, oszacuj całkowitą ilość potrzebnych IE i odpowiednio zwiększ liczbę kultur pasożytów. Kolba hodowlana o średnicy 75cm2 z 25 ml kultury przy 5% hematokrycie i 5-10% parazytemii powinna dać wystarczającą ilość IE, aby uruchomić pełną 96-dołkową płytkę. W przypadku pełnej płytki (42 próbki plus 6 kontroli w dwóch częściach) potrzebne jest co najmniej 1,5 ml zawiesiny pasożyta o stężeniu 3,3 x 107 IEs/ml.
2. Komórki THP-1
UWAGA: Linia komórkowa THP-1 jest używana w tym teście. Ta linia komórek monocytów pochodzi od pacjenta z białaczką monocytową i można ją kupić w American Type Culture Collection (ATCC). Utrzymuj linię komórkową zgodnie z instrukcjami dostawcy w pożywce hodowlanej THP-1 (patrz Tabela materiałów).
- W celu regularnej konserwacji rozpocznij hodowlę komórek THP-1 przy 2-4 x 105 komórek/ml i subkulturę, gdy stężenie komórek osiągnie 8 x 105 komórek/ml.
nuta: Nie pozwól, aby stężenie komórek przekroczyło 1 x 106 komórek/ml i śledź numer przejścia. Unikaj używania komórek, które nie są w stanie przejść 25. Średni czas podwajania linii komórkowej THP-1 waha się w granicach 19-50 godzin. Określ czas podwajania partii komórek przed rozpoczęciem eksperymentów z fagocytozą. Pomoże to w przybliżeniu oszacować niezbędną ilość kultury potrzebną do zbadania określonej liczby próbek surowicy (np. w przypadku pełnej płytki 96-dołkowej potrzeba 10 ml kultury o wymiarach 5 x 105 komórek/ml).
- Okresowo sprawdzaj komórki THP-1 pod kątem ekspresji powierzchniowej receptorów Fcγ I (CD64), II (CD32) i III (CD16), jak opisano wcześniej.
- Krótko mówiąc, wybarwić komórki THP-1 (oddzielnie) przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie anty-CD64, anty-CD32 i anty-CD16 (tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze pokojowej (rozcieńczenie 1:100 przygotowane w 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Przemyć trzykrotnie 2% FBS w PBS i zmierzyć barwienie powierzchni za pomocą cytometrii przepływowej.
nuta: Komórki THP-1 są ujemne dla CD16 i dodatnie dla CD32 i CD64, jak wcześniej zgłoszono (Figura 1).
- Do testu fagocytozy należy ustawić kolbę do hodowli komórek THP-1 z 2,5 x 105 komórek/ml dzień przed eksperymentem, aby uzyskać około 5 x 105 komórek/ml w dniu testu.
nuta: Upewnij się, że 4-6 x 105 komórek/ml jest obecnych w dniu testu.
3. Test fagocytozy (Rysunek 2)
- Przed rozpoczęciem testu należy zablokować (>1 h) dwie 96-dołkowe płytki okrągłodenne (jedną do opsonizacji, a drugą do fagocytozy) przy użyciu 150 μl na studzienkę sterylnego 2% FBS w PBS.
nuta: Oznacz płytkę 1 jako płytkę opsonizacyjną i używaj jej zarówno do barwienia bromkiem etydyny (EtBr), jak i opsonizacji. Oznacz płytkę 2 jako płytkę fagocytozy i użyj zarówno do posiewu komórek THP-1, jak i do etapu fagocytozy.
- Barwienie i opsonizacja pasożytów
- Pobrać zawiesinę IE przygotowaną w 1,6 i dostosować liczbę komórek do 3,3 x 107 IEs/ml, dodając pożywkę do hodowli pasożytów i bromek etydyny (EtBr), aby osiągnąć końcowe stężenie 2,5 μg/ml (rozcieńczenie 1:40, z 0,1 mg/ml podstawy).
nuta: EtBr barwi DNA pasożyta, umożliwiając wykrycie za pomocą cytometrii przepływowej.
ostrożność: EtBr jest mutagenem i działa drażniąco na skórę, oczy i drogi oddechowe. Stosuj odpowiednie zabezpieczenia i utylizuj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami.
- Usunąć roztwór blokujący z jednej z 96 płytek dołkowych (płytki opsonizacyjnej), strzepując płytkę i usuwając nadmiar płynu z kawałka ręcznika.
- Dodać 30 μl do dołka zawiesiny IE przygotowanej powyżej w górnej połowie płytki. Pozostawić jedną studzienkę pustą i dodać 30 μl pożywki do hodowli pasożytów (bez IE do kontroli samego THP-1). (Rysunek 3A). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.
- Dodać 170 μl pożywki do hodowli pasożytów na studzienkę. Obracać płytkę o masie 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant, przesuwając płytkę nad odpowiednim pojemnikiem na odpady.
- Przemyć IE znakowane EtBr jeszcze dwa razy, używając 200 μl na studzienkę pożywki do hodowli pasożytów, obracając płytkę przy 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Supernatant z pierwszego prania można usunąć, przesuwając płytkę. Ostrożnie usunąć supernatant z drugiego płukania za pomocą pipety wielokanałowej, aby upewnić się, że cała objętość medium myjącego została usunięta. Nie naruszaj pelletu.
- Zawiesić IE znakowane EtBr w 30 μl roztworu przeciwciała/osocza/surowicy przygotowanego w żądanych stężeniach w pożywce do hodowli pasożytów.
- Zawsze uwzględniaj następujące kontrole (ryc. 3B): kontrolę bez kontroli komórek IEs/THP-1 (pożywka do hodowli pasożytów); kontrolę bez przeciwciał lub osocza/surowicy (kontrola nieopsonizowana); kontrolę pozytywną z użyciem dostępnego w handlu króliczego przeciwciała przeciwko ludzkim erytrocytom w rozcieńczeniu 1:100 (patrz tabela materiałów); dwie ujemne próby kontrolne osocza/surowicy w rozcieńczeniu 1:5 (pula nieleczona wcześniej malarią i pula mężczyzn narażonych na malarię); oraz dodatnia kontrola surowicy w rozcieńczeniu 1:5 (pula od kobiet narażonych na malarię, które wcześniej były w ciąży (najlepiej multigravidae).
nuta: Rozcieńczenie 1:100 dla kontroli pozytywnej wydaje się działać spójnie w różnych seriach zakupionych przeciwciał (dane nie pokazane). Zaleca się jednak wykluczenie różnic między partiami poprzez testowanie kilku rozcieńczeń za każdym razem, gdy używana jest nowa partia przeciwciał.
- Inkubować przez 45 minut w ciemności w temperaturze 37 °C.
- Przygotowanie komórek THP-1 i fagocytoza
- Podczas gdy IE są opsonizowane (3.2.8), zacznij przygotowywać komórki THP-1.
- Wyjąć komórki THP-1 z kolby hodowlanej, odwirować je (500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej), zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce do hodowli komórek THP-1.
- Ponownie odwirować (500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej), zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do hodowli komórek THP-1.
- Oznaczyć liczbę komórek w roztworze przygotowanym powyżej i dodać więcej pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 5 x 105 komórek/ml.
- Usuń roztwór blokujący z pozostałej płytki 96-dołkowej (płytki fagocytozy), trzepając płytką i usuwając nadmiar płynu na kawałku ręcznika.
- Dodać 100 μl zawiesiny komórek THP-1 przygotowanej w 3.3.4 na studzienkę i umieścić ją z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych (ryc. 3C).
- Po zakończeniu czasu inkubacji przeciwciała/osocza/surowicy dodać 170 μl pożywki do hodowli pasożytów na studzienkę. Obracać płytkę o masie 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant, przesuwając płytkę nad odpowiednim pojemnikiem na odpady.
- Przemyć opsonizowane IE jeszcze dwa razy, używając 200 μl na studzienkę pożywki do hodowli pasożytów, obracając płytkę o masie 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Supernatant z pierwszego prania można usunąć, przesuwając płytkę. Ostrożnie usunąć supernatant z drugiego płukania, używając pipety wielokanałowej, aby upewnić się, że cała objętość medium myjącego została usunięta. Nie naruszaj pelletu.
- Na koniec ponownie zawiesić opsonizowane IE w 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórek THP-1. Przenieś 50 μl opsonizowanej zawiesiny IE do każdej studzienki na płytce fagocytozy. Ponieważ w sumie jest 100 μl IE, każde rozcieńczenie przeciwciała/surowicy można przeprowadzić w dwóch powtórzeniach na płytce fagocytozy (ryc. 3D)
nuta: Ilość komórek IE i THP-1 użytych w teście odpowiada stosunkowi 10:1.
- Inkubować przez 40 minut w ciemności w temperaturze 37 °C, 5% dwutlenku węgla (CO2).
nuta: Nie pozwól, aby fagocytoza postępowała dłużej niż 40 minut.
- Zatrzymać fagocytozę przez odwirowanie w temperaturze 4 °C (500 x g, 5 min) i wyrzucić supernatant, przesuwając płytkę. Dodać 150 μl roztworu lizy chlorku amonu o temperaturze pokojowej (tabela materiałów) i wymieszać pipetując, inkubować dokładnie przez 3 minuty
nuta: Ten etap spowoduje lizę erytrocytów, które nie zostały fagocytozowane przez komórki THP-1.
- Zatrzymaj lizę, dodając 100 μl lodowatego 2% FBS do PBS. Odwirować płytkę w temperaturze 4 °C (500 x g przez 3 min) i usunąć supernatant, przesuwając płytkę nad odpowiednim pojemnikiem na odpady.
- Umyć trzykrotnie, używając 200 μl na studzienkę lodowatego 2% FBS w PBS, obracając płytkę w temperaturze 4°C (500 x g przez 3 min). Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić w 200 μl lodowatego 2% FBS w PBS i natychmiast przeanalizować metodą cytometrii przepływowej.
nuta: W poprzednich publikacjach stosowano utrwalanie komórek w 2% paraformaldehydzie przed cytometrią przepływową31, ale przedstawione tutaj wyniki uzyskano natychmiast po zakończeniu testu. Nie zaleca się odkładania pozyskiwania danych z cytometrii przepływowej poprzez przechowywanie płytki w temperaturze 4°C, ponieważ odsetek komórek EtBr + THP-1 szybko się rozpada (ryc. 4).
4. Akwizycja i analiza cytometrii przepływowej
UWAGA: Można użyć dowolnego cytometru przepływowego obsługującego format płytki 96-dołkowej i posiadającego odpowiednie lasery/filtry do pomiaru fluorescencji EtBr.
- W celu akwizycji należy przeprowadzić bramkę na komórkach THP-1 za pomocą liniowego wykresu rozproszenia do przodu (FSC) w porównaniu z liniowym rozproszeniem bocznym (SSC) przy użyciu studzienek, do których nie dodano żadnych IE (rysunek 2A) i uzyskać 10 000 zdarzeń na tej bramce.
- Zmierz intensywność fluorescencji dla EtBr (FL3-Log) na bramce THP-1 za pomocą wykresu histogramu.
- W przypadku bramkowania, pierwsza bramka na komórkach THP-1 na wykresie gęstości FSC w porównaniu z SSC, przy użyciu studzienek, w których nie dodano żadnych IE (Rysunek 5A). Następnie ustaw bramkę dodatnią na histogramie FL3 (EtBr), używając komórek THP-1 (bez dodanych IE) i kontroli nieopsonizowanej (Figura 5B).
- Skopiuj te bramki we wszystkich innych próbkach testowanych na tej samej płytce i określ procent komórek THP-1 EtBr-dodatnich (komórek THP-1, które mają fagocytację co najmniej jednego IE). Dla każdej z badanych próbek fagocytozę można podać jako wartości bezwzględne (procent komórek EtBr + THP-1) lub jako względną fagocytozę obliczoną jako procent przy użyciu kontroli dodatniej jako maksimum.
