UWAGA: Poniższe protokoły opisują przygotowanie próbki i kwantyfikację aktywności proteaz neutrofilowych seryny (NSP). Przedstawione w niniejszym dokumencie procedury eksperymentalne koncentrują się na pomiarze aktywności ludzkiej plwociny i elastazy neutrofilowej (NE) lub katepsyny G (CG). Jednak niewielkie adaptacje w protokole przygotowania próbki umożliwiają analizę komórek pochodzących z krwi i homogenatów guza. Ponadto aktywność metaloproteinazy macierzy i katepsyny S można badać w podobny sposób za pomocą dedykowanych sond FRET
1. Przygotowanie próbki: izolacja komórek i separacja supernatantu
UWAGA: Jeśli to możliwe, leczenie plwociny powinno być przeprowadzone w ciągu 120 minut po odkrztuszaniu, a plwocina powinna być przechowywana na lodzie do czasu dalszego przetwarzania.
- Jeśli spontaniczne odkrztuszanie plwociny nie jest możliwe, należy wywołać plwocinę zgodnie z wcześniejszym opisem. Krótko wdychać 200 μg antagonisty receptora β-2 salbutamolu przed rozpoczęciem procedury indukcji plwociny. Następnie wdychaj hipertoniczny (6%) roztwór soli fizjologicznej przez 15 minut za pomocą nebulizatora. Zbierz odkrztuszoną plwocinę na szalce Petriego.
- Oddziel grudki śluzu ze śliny na szalkę Petriego za pomocą końcówki pipety.
- Zważ śluz.
nuta: Średnia masa próbki śluzu wynosi 0,8 g (waha się od 0,1 g do 5 g); Do wykonania wymienionych zabiegów zwykle wystarcza 0,1 g.
- Dodaj 4 części (v/w) 10% sputolizyny (w PBS) do plwociny (na przykład 4 ml 10% sputolizyny na każdy gram plwociny).
ostrożność: Sputolizyna składa się ze skoncentrowanego ditiotreitolu w buforze fosforanowym, dlatego należy obchodzić się z nią ostrożnie.
- Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) na kołyszącym się wytrząsarce przez 15 minut, aby rozpuścić śluz. Ze względów bezpieczeństwa należy umieścić wytrząsarkę w dygestorium.
- Ugasić reakcję, dodając tę samą objętość zimnego PBS (na przykład: 1 ml zimnego PBS na każdy ml 10% sputolizyny).
- Mieszać pipetując do uzyskania jednorodnego roztworu.
- Przefiltrować mieszaninę przez sitko z nylonu o średnicy 100 μm do probówki o pojemności 50 ml.
- Powtórz etap filtracji przez sitko nylonowe o średnicy 40 μm.
- Odwirowywać roztwór przez 10 minut przy 300 x g w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie przenieść frakcję sklarowaną nad osadem do świeżej probówki i przechowywać ją na lodzie.
nuta: Frakcje supernatantu mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu dalszej analizy.
- Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 500 μl zimnego PBS i umieścić go na lodzie.
nuta: Frakcja komórkowa musi zostać natychmiast przetworzona.
2. Pomiar aktywności proteazy neutrofilowej seryny
UWAGA: Tutaj wprowadzono różne metody ilościowego określania aktywności NSP za pomocą reporterów FRET. Wybór technologii jest podyktowany konkretnym pytaniem biomedycznym i celem eksperymentu. Zaprezentowane sondy zostały dokładnie przetestowane pod kątem ich specyficzności w stosunku do zestawu enzymów istotnych dla płuc. Chociaż sondy są specyficzne dla docelowego enzymu, zawsze sprawdzaj swoistość sondy na interesującej nas próbce klinicznej. Można to osiągnąć poprzez inkubację próbki ze specyficznym inhibitorem proteazy przed dodaniem sondy, co powinno znieść jakikolwiek wzrost stosunku donor/akceptor (D/A).
- Kwantyfikacja aktywności rozpuszczalnego NSP za pomocą testu fluorymetru lub czytnika płytek
nuta: Aktywność proteazy w rozpuszczalnych frakcjach próbki można wykryć za pomocą dowolnego przyrządu zdolnego do wykrywania fluorescencji.
- Rozmrozić enzymy na lodzie.
- Do czasu użycia należy przechowywać NE i CG w kwaśnym buforze magazynującym (50 mM octan sodu, 200 mM NaCl, pH 5,5), aby zapobiec samorozszczepieniu.
- Aby ustalić krzywą wzorcową enzymu, należy przygotować seryjne rozcieńczenie enzymu w stosunku 1:2 (33,9 - 0,271 nM dla NE; 42,6 - 0,333 nM dla CG) w buforze aktywacyjnym (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl przy pH 7,5). Bufor aktywacyjny ma neutralne pH, dzięki czemu kataliza enzymatyczna może przebiegać efektywnie.
- Aby przygotować najwyższe stężenie wzorcowe (stężenie NE: 33,9 nM), należy rozcieńczyć 1 μL NE (33,9 μM) w 999 μL buforu aktywacyjnego.
- Aby przygotować drugi wzorzec (stężenie NE: 16,95 nM), należy zmieszać 200 μl pierwszego rozcieńczenia z 200 μl buforu aktywacyjnego.
- Postępuj odpowiednio, aby przygotować pozostałe rozcieńczenia 1:2.
- Ostatni wzorzec, którym jest ślepa próba, składa się z czystego bufora aktywacyjnego. Zaleca się pomiar duplikatów technicznych lub potrójnych egzemplarzy. Podczas przygotowywania wzorca i próbki należy starać się, aby fiolki były na lodzie.
- Równolegle z preparatem wzorcowym rozcieńczyć próbki plwociny w buforze aktywacyjnym. Rozcieńczyć próbki ludzkie przed oceną ich aktywności proteazy, aby pozostać w liniowym zakresie wzrostu sygnału reporterowego (stosunek D/A). Gdyby próbki pacjenta pozostały nierozcieńczone, rozszczepienie nastąpiłoby zbyt szybko, aby można było je wiarygodnie dopasować. Ponieważ zdrowa plwocina dawcy zawiera mniej aktywnych proteaz w porównaniu z próbkami pobranymi od pacjentów z mukowiscydozą (CF) i przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP), na ogół wykonuje się różne rozcieńczenia (1:10 dla zdrowego supernatantu plwociny, 1:20-500 dla supernatantu plwociny u pacjentów z POChP lub mukowiscydozą).
nuta: W celu ilościowego pomiaru aktywności proteazy w próbkach, w których jej stężenie jest nieznane, należy zmierzyć krzywą wzorcową ze znanymi stężeniami enzymów, najlepiej na tej samej płytce. Stężenie aktywnego enzymu w ludzkiej plwocinie oblicza się poprzez interpolację nachyleń zmierzonych w próbkach ludzkiej plwociny z tymi zmierzonymi za pomocą krzywych standardowych.
- Przed przygotowaniem próbek do pomiaru należy skonfigurować przyrząd. Ustaw długość fali wzbudzenia dla sondy NE Förster resonance energy transfer-based (FRET) (NEmo-1) na 354 nm i ustaw długość fali detekcji na 400 nm dla donora i 490 nm dla akceptora. Ustaw długość fali wzbudzenia dla sondy CG FRET (sSAM) na 405 nm, a emisję ustaw na 485 (donor) i 580 nm (akceptor).
- Dodać 40 μl próbek, wzorcowych lub ślepych, do studzienek czarnej 96-dołkowej płytki o połowie powierzchni.
- W celu przygotowania mieszanki wzorcowej zawierającej reportery (stężenie reportera w mieszance głównej: 10 μM), należy rozcieńczyć materiał sondy (1 mM w dimetylosulfotlenku, DMSO) w stosunku 1:100 w buforze aktywacyjnym. Przygotować potrzebną objętość mieszanki wzorcowej, mnożąc 10 μl x liczbę wymaganych dołków na płytki. Aby osiągnąć optymalne stężenie końcowe (2 μM) do pomiaru fluorescencji reporterów NEmo-1 i sSAM, należy dodać 10 μl mieszanki wzorcowej do każdej studzienki (zawierającej 40 μl próbki, wzorca lub próby ślepej) i rozpocząć odczyt. Reportery NEmo-1 i sSAM będą zatem monitorować odpowiednio aktywność rozpuszczalnej elastazy neutrofilowej i katepsyny G.
nuta: Jeśli wstrzykiwacz odczynnika nie jest dostępny, należy rozpocząć odczyt tak szybko, jak to możliwe po dodaniu reportera do próbek.
- Rozpocznij pomiar czytnikiem płytek i zapisuj wzrost współczynnika cyfrowo-analogowego co 60-90 sekund przez co najmniej 20 minut lub do momentu, gdy wzrost sygnału osiągnie plateau.
- Po wyeksportowaniu danych oblicz stosunek cyfrowo-analogowy, dzieląc względne jednostki fluorescencji dawcy (RFU) przez akceptora RFU dla każdego punktu czasowego i próbki.
- Obliczyć średni stosunek cyfr do przejęć i odchylenie standardowe każdej próbki.
- Określ nachylenie w obrębie liniowego wzrostu zmiany współczynnika C/A. Nachylenie jest wskaźnikiem szybkości rozszczepienia enzymu dla sondy FRET. Obliczyć stężenie aktywnego enzymu w plwocinie, dopasowując nachylenia regresji liniowej uzyskane z próbek ludzkich z nachyleniami obliczonymi na podstawie wzorca enzymu.
