$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego.
- Przygotowanie testu migracji komórek mikroprzepływowych
- Przygotować 50 μg/ml roztworu fibronektyny, rozcieńczając 50 μl podstawowego roztworu fibronektyny (1 mg/ml) do 950 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Przygotować pożywkę migracyjną, mieszając 9 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) i 1 ml RPMI-1640 z 4% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
- Usuń wodę dejonizowaną z urządzenia.
- Dodaj 100 μl roztworu fibronektyny do urządzenia z wylotu. Odczekaj 3 minuty, aby upewnić się, że wszystkie kanały są wypełnione roztworem fibronektyny. Umieścić urządzenie mikroprzepływowe na przykrytej szalce Petriego na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Usuń roztwór fibronektyny z urządzenia. Dodać 100 μl pożywki migracyjnej z wylotu. Odczekaj 3 minuty, aby upewnić się, że wszystkie kanały są wypełnione medium migracyjnym.
- Inkubować urządzenie przez kolejne 1 godzinę w temperaturze pokojowej; następnie urządzenie jest gotowe do eksperymentu chemotaksji.
- Przygotowanie roztworu chemoatraktantu do eksperymentu z chemotaksją.
- Przygotować 100 nM roztwór fMLP w łącznej objętości 1 ml pożywki migracyjnej. Wymieszaj 5 μl podstawowego FITC-Dekstranu (10 kDa, 1 mM) z roztworem fMLP w probówce o pojemności 1,5 ml.
nuta: FITC-Dekstran służy do pomiaru gradientu. Alternatywnie użyj rodaminy jako wskaźnika gradientu. Roztwór chemoatraktantu fMLP jest następnie gotowy do eksperymentu z chemotaksją.
- Przygotowanie próbki plwociny.
nuta: Chemotaksja neutrofili indukowana gradientem próbek plwociny od pacjentów z POChP została przetestowana jako kliniczne zastosowanie diagnostyczne tej metody all-on-chip.
- Uzyskaj protokół etyczny dla ludzi, aby pobrać próbki plwociny od pacjentów z POChP.
nuta: Uzyskaliśmy zgody na pobieranie próbek w Seven Oaks General Hospital w Winnipeg (zatwierdzone przez University of Manitoba).
- Uzyskaj formularze świadomej pisemnej zgody od wszystkich uczestników.
- Pobieranie spontanicznych próbek plwociny od pacjentów z POChP. Umieść próbkę plwociny o pojemności 500 μl w probówce o pojemności 1,5 ml.
- Dodaj 500 μl 0,1% ditiotreitolu do probówki o pojemności 1,5 ml i delikatnie wymieszaj. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut.
- Odwirować próbkę o sile 753 x g przez 10 minut, a następnie zebrać supernatant. Odwirować sklarowany stężeń 865 x g przez 5 minut, a następnie zebrać końcowy supernatant. Zebrany supernatant należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C przed użyciem.
- Gdy będziesz gotowy do eksperymentu z chemotaksją, rozmrozić roztwór plwociny; przenieść 900 μl pożywki migracyjnej do probówki o pojemności 1,5 ml i wymieszać ze 100 μl roztworu plwociny w komorze bezpieczeństwa biologicznego; roztwór plwociny jest następnie gotowy do eksperymentu chemotaksji.
- Pobranie próbki krwi.
- Uzyskaj protokół etyki ludzkiej, aby pobrać próbki krwi od zdrowych dawców. Należy uzyskać formularze świadomej pisemnej zgody od wszystkich dawców krwi.
nuta: W tym przypadku próbki zostały pobrane w Victoria General Hospital w Winnipeg (zatwierdzone przez Wspólną Wydziałową Radę ds. Etyki Badań Naukowych na Uniwersytecie Manitoba).
- Pobrać próbkę krwi przez nakłucie żyły i umieścić próbkę w probówce pokrytej EDTA. Przed eksperymentem należy przechowywać probówkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Operacja testu chemotaksji typu "wszystko na chipie
"
- Izolacja ogniw w układzie scalonym (rysunek 1B).
- Umieść 10 μl krwi pełnej w probówce o pojemności 1,5 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
nuta: Szczegółowe informacje na temat pobierania próbek krwi znajdują się w punkcie 1.4.
- Dodać 2 μl koktajlu przeciwciał (Ab) i 2 μl cząstek magnetycznych (MP) z zestawu do izolacji neutrofili (patrz tabela materiałów) do probówki o pojemności 1,5 ml i delikatnie wymieszać, co spowoduje oznaczenie komórek we krwi z wyjątkiem neutrofili.
- Inkubować mieszaninę krew-Ab-MP przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
nuta: Spowoduje to magnetyczne znakowanie komórek znakowanych przeciwciałami we krwi.
- Podłącz dwa małe dyski magnetyczne po obu stronach portu ładowania ogniw urządzenia. Zassać pożywkę ze wszystkich portów urządzenia.
- Powoli pipetować 2 μl mieszaniny krwi-Ab-MP do urządzenia mikroprzepływowego z portu ładowania ogniwa.
UWAGA: Magnetycznie znakowane komórki są uwięzione w bocznych ściankach portu ładowania ogniw, podczas gdy neutrofile wpływają do urządzenia i zostają uwięzione w strukturze dokowania komórki.
- Poczekaj kilka minut, aż wystarczająca ilość neutrofili zostanie uwięziona w obszarze dokowania komórki.
3. Test chemotaksji (Rysunek 1C).
- Umieścić urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu z kontrolowaną temperaturą w temperaturze 37 °C.
- Dodać 100 μl roztworu chemoatraktantu (fMLP lub roztwór plwociny) i 100 μl pożywki migracyjnej do wyznaczonych zbiorników wlotowych za pomocą dwóch pipetorów; spowoduje to wytworzenie gradientu chemoatraktantu w kanale gradientowym przez ciągłe mieszanie chemiczne oparte na przepływie laminarnym wspomagane przez strukturę równoważącą ciśnienie.
nuta: Szczegółowe informacje na temat pobierania plwociny od pacjentów z POChP znajdują się w punkcie 1.3.
- W eksperymencie kontrolnym pożywki należy dodać pożywkę migracyjną tylko do obu zbiorników wlotowych.
- Uzyskaj obraz fluorescencyjny FITC-Dekstranu w kanale gradientowym.
- Zaimportuj obraz do oprogramowania ImageJ za pomocą polecenia "Plik|Otwórz".
- Zmierz profil intensywności fluorescencji w całym kanale gradientu za pomocą polecenia "Analizuj|Profil działki".
- Eksportuj dane pomiarowe do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszego kreślenia.
- Inkubować urządzenie na stoliku mikroskopowym z kontrolowaną temperaturą lub w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych przez 15 minut.
- Zobrazuj kanał gradientu za pomocą obiektywu 10X, aby zarejestrować końcowe pozycje komórek do analizy danych.
- W razie potrzeby zarejestruj migrację komórek w urządzeniu za pomocą mikroskopii poklatkowej.
4. Analiza danych migracji komórek (Rysunek 1C)
- Przeanalizuj test chemotaksji, obliczając odległość migracji komórek od struktury dokowania, jak opisano poniżej. Zobacz rysunek 1C.
- Zaimportuj obraz do oprogramowania NIH ImageJ (wer. 1.45).
- Zaznacz środek każdej komórki, która została przeniesiona do kanału gradientu.
- Zmierz współrzędne wybranych komórek dla ich ostatecznych pozycji. Zmierz współrzędną punktu na krawędzi konstrukcji dokowania jako początkową pozycję odniesienia.
- Eksport zmierzonych danych współrzędnych do arkusza kalkulacyjnego (np. Excel). Oblicz odległość migracji komórek jako różnicę między końcowym położeniem komórki a początkowym położeniem odniesienia wzdłuż kierunku gradientu.
- Skalibruj odległość z dokładnością do mikrometra. Oblicz średnią i odchylenie odległości migracji wszystkich komórek jako miarę chemotaksji.
- Porównaj odległość migracji w obecności gradientu chemoatraktantu z eksperymentem kontrolnym pożywki za pomocą testu t-Studenta.
- Jeśli zostaną zarejestrowane obrazy poklatkowe migracji komórek, migracja komórek i chemotaksja mogą być dalej analizowane za pomocą analizy śledzenia komórek.
nuta: Materiały wymagane do skonstruowania i przeprowadzenia testu chemotaksji typu "wszystko na chipie" są szczegółowo opisane w tabeli materiałów.
