$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Analiza cytokin łzowych
- Kolekcja łez:
- Poproś badanego, aby usiadł wygodnie na krześle do badań i oparł głowę o zagłówek.
- Poproś badanego, aby spojrzał w górę, ostrożnie otwórz paski Schirmera (wykonane z bibuły filtracyjnej Whatman nr 41), umieść zaokrąglony koniec paska na dolnej złoczu oka i poinstruuj badanego, aby zamknął oczy na 5 minut. Podczas zbierania łez należy zachować szczególną ostrożność, aby zminimalizować kontakt z powierzchnią oka.
- Poproś badanego, aby otworzył oczy w celu wyjęcia paska i umieszczenia go w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Natychmiast przenieś probówkę do laboratorium lub przechowuj ją w temperaturze -80 oC do czasu przeprowadzenia testów na profilowanie cytokin.
- Elucja próbki łez z paska przepływu łez:
- Przytnij pasek do łez na długość 0,5 cm (w celu ujednolicenia ilości łez do badania) i umieść go w sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
- Dodać 30 μl buforu do oznaczania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie odwirować probówkę przy 14 000 x g przez 1 min.
- Przenieść supernatant do innej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wyrzucić pasek. Umieścić próbkę zawierającą probówkę na lodzie i natychmiast użyć wymytej próbki łez do profilowania cytokin.
- Przygotowanie odczynników:
UWAGA: Czterdzieści jeden analitów, które mają być badane w każdej próbce za pomocą testu multipleksowego na bazie perełek, to: interleukina (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferon-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-indukowane białko 10 (IP-10, CXCL10), chemokina pochodząca z makrofagów (MDC), białko zapalne makrofagów (MIP)-1α i MIP-1β, białko chemotaktyczne monocytów (MCP)-1, MCP-3, czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α), TNF-β, onkogen regulowany wzrostem (GRO), czynnik wzrostu nowotworu alfa (TGF-α), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)-2, płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), eotaksyna, fraktalkina, rozpuszczalny ligand CD40 (sCD40L), ligand kinazy tyrozynowej 3 podobny do Fms (Flt-3L) i regulowany po aktywacji, normalne białko wyrażane i wydzielane przez limfocyty T (RANTES).
- Doprowadź fiolki z roztworem kulek przeciwciała (50X) do temperatury pokojowej (20 – 25 oC) i wiruj fiolki przez 1 minut.
- Policz liczbę dołków wymaganych do testu i oblicz ilość całkowitego roztworu koktajlu kulek przeciwciał (25 μl na studzienkę) i każdego roztworu kulki przeciwciała (50X) wymaganego do testu.
- Przygotuj roztwór koktajlowy, dodając obliczoną ilość każdego roztworu kulki przeciwciała i napełnij do pożądanej objętości końcowej, dodając pozostałą ilość rozcieńczalnika do kulek. Upewnij się, że końcowe stężenie każdego przeciwciała w koktajlu wynosi 1X. Zawsze przygotuj co najmniej 20% dodatkowej objętości roztworu koktajlowego na wypadek błędów w pipetowaniu.
UWAGA: Na przykład, dla testu 96-dołkowego przygotuj 3000 μl roztworu koktajlu kulek przeciwciał. Wymagana ilość każdego roztworu kulki przeciwciała = 3000/stężenie podstawowe każdego roztworu kulki przeciwciała; 3000/50 = 60 μl każdego roztworu kulki przeciwciała
- Dodać 60 μl każdego z 41 roztworów kulek przeciwciał (60 X 41 = 2460 μL) do butelki koktajlowej i dodać 540 μl roztworu rozcieńczalnika do kulek do mieszaniny kulek przeciwciał, aby uzyskać 3000 μL końcowego roztworu roboczego (1X).
- Przed użyciem należy dokładnie wymieszać roztwór koktajlu kulkowego. Po wykonaniu testu pozostałą objętość należy przechowywać w temperaturze 2-8 oC przez okres do 30 dni.
- Przygotuj kontrole jakości (QC), dodając 250 μl wody dejonizowanej do zapasów QC 1 i QC 2.
- Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając butelki i wirując przez 10 sekund. Przenieść roztwór do odpowiednio oznakowanych probówek do mikrowirówek polipropylenowych i przechowywać pozostały roztwór w temperaturze -20 oC, który może być używany przez okres do 30 dni.
- Przygotować bufor do płukania, dodając 270 ml wody dejonizowanej do 30 ml 10-krotnego roztworu buforowego do przemywania i dobrze wymieszać (przed rozcieńczeniem doprowadzić 10-krotny bufor do temperatury pokojowej i rozpuścić wszystkie osady soli przez mieszanie). Niewykorzystany bufor do płukania (1X) należy przechowywać w temperaturze 2-8 oC, który może być używany do 30 dni.
- Przygotować standardowy zapas cytokin ludzkich (10 000 pg/ml wszystkich analitów), dodając 250 μl wody dejonizowanej do fiolki podstawowej. Dobrze wymieszaj, odwracając kilka razy i obracając fiolkę przez 10 sekund. Odstawić na 10 minut i przenieść roztwór podstawowy do odpowiednio oznakowanych probówek wirówkowych z polipropylenu. Po wykonaniu testu należy przechowywać pozostały roztwór w temperaturze -20 oC, który można stosować do 30 dni.
- Przygotuj robocze wzorce cytokin ludzkich przez 5-krotne seryjne rozcieńczenia (50 μL -> 200 μL) z buforem testowym, aby uzyskać 2000, 400, 80, 16 i 3,2 pg/ml.
- Po przygotowaniu wzorca należy użyć wzorców roboczych w ciągu 60 minut i użyć buforu do oznaczania jako ślepej próby/tła (-pg/ml).
- Profilowanie cytokin za pomocą testu multipleksowego opartego na kulkach:
- Doprowadź wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej i wiruj przez 5-10 sekund przed dodaniem ich do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Jeśli eluowane próbki łez są przechowywane w temperaturze -80 oC przed testem, rozmrozić zamrożone ekstrakty ze łez na lodzie i odwirować przy 1000 X g przez 5 minut.
- Przygotuj arkusz testowy w konfiguracji pionowej dla roboczych wzorców cytokin ludzkich [0 (ślepa), 3,2, 16, 80, 400, 2,000 i 10,000 pg/mL], QC1, QC2 i próbki.
- Dodaj 200 μL buforu do płukania 1X do każdego dołka płytki, uszczelnij ją zgrzewarką do płytek i trzymaj na wytrząsarce płytek w temperaturze pokojowej (20-25 oC) przez 10 minut.
- Zdekantuj bufor myjący 1X, odwracając płytkę i kilkakrotnie przyklejając ją do chłonnych ręczników, aby usunąć resztki buforu do płukania w studzienkach.
- Dodać 25 μl każdego działającego wzorca cytokin ludzkich, QC1, QC2, ślepej próby (bufor testowy) i próbek do odpowiednich studzienek.
- Dodać 25 μl buforu do oznaczania do każdego dołka.
- Dodaj 25 μl roztworu koktajlu kulek przeciwciał 1X do każdej studzienki. Ponieważ roztwór kulki przeciwciała jest wrażliwy na światło, należy uszczelnić płytkę uszczelniaczem do płytek i przykryć ją folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem podczas testu.
- Inkubować płytkę w temperaturze 4 oC przez noc na shakerze.
- Umieść płytkę na stojaku na talerze automatycznej magnetycznej myjki do płyt. Pozostaw na 1 minutę, aby osadzać kulki magnetyczne na dnie studzienki i zassać zawartość studzienki. Dodać 200 μl buforu do płukania na studzienkę, pozostawić na 1 minutę, a następnie odessać zawartość studzienki. Powtórz pranie jeszcze raz (w przypadku mycia talerzy postępuj zgodnie z instrukcjami producenta zestawu).
- Do każdej studzienki dodać 25 μl roztworu przeciwciał wykrywających, uszczelnić płytkę, przykryć folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut na shakerze.
- Do każdej studzienki dodać 25 μl roztworu Streptawidyny-Fikoerytryny, uszczelnić płytkę, przykryć folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut na shakerze.
- Umieść płytkę na magnetycznej podkładce do płyt. Pozostaw na 1 minutę, a następnie odessaj zawartość studzienki. Dodać 200 μl buforu do płukania na studzienkę. Pozostaw na 1 minutę, a następnie odessaj zawartość studzienki. Powtórz pranie jeszcze raz.
- Dodać 150 μl płynu osłonkowego do każdej studzienki i umieścić płytkę na wytrząsarce na 5 minut w temperaturze pokojowej w celu ponownego zawieszenia kulek przeciwciała.
- Natychmiast odczytaj płytkę za pomocą czytnika płytek do testów multipleksowych na bazie kulek i przeanalizuj stężenia cytokin za pomocą 5-parametrowego algorytmu dopasowania krzywej. Schematyczny schemat przepływu profilowania cytokin łzowych pokazano na rysunku Rysunek 1.
- Odczyt tabliczki testowej (ustawienie przyrządu) i analiza danych:
- Włącz czytnik multipleksowy na bazie perełek i podgrzewaj laser przez 30 minut.
- Uruchom oprogramowanie do oznaczania multipleksów oparte na koralikach. W zakładce "Automatyczna konserwacja" wybierz opcję "Kalibracja-weryfikacja". Wirować każdą fiolkę z odczynnikiem z kulkami kalibracyjnymi i weryfikacyjnymi przez 30 sekund. Umieść 5 kropli każdego odczynnika w wyznaczonych studzienkach. Napełnij wyznaczone zbiorniki wodą dejonizowaną i 70% etanolem.
