Wykorzystanie fluorescencji immuno-RNA Hybrydyzacja in Situ do wizualizacji SARS-CoV-2

1. SARS-CoV-2 RNA-FISH w komórkach Vero hodowanych na szkiełkach nakrywkowych

DZIEŃ 1

1. Utrwalanie i przepuszczalnie komórek
   1. Napraw zainfekowane komórki za pomocą 3,7% w/v roztworu PFA przez 1 godzinę w RT.
   2. Odessać 3,7% roztwór PFA i dwukrotnie umyć komórki za pomocą 1x PBS.
   3. Przepuszczać komórki roztworem PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
   4. Odessać PBST i dwukrotnie umyć komórki 1x PBS.
2. wykrywanie
   1. Odessać 1x roztwór PBS i dwukrotnie przemyć komórki 2x SSC w RT.
   2. Odessać 2x roztwór SSC i wstępnie zhybrydyzować próbki, dodając co najmniej 300 μl buforu do hybrydyzacji sondy. Przykryć studzienki zawierające komórki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
   3. Przygotować roztwór sondy, dodając 1,2 pmol mieszaniny sondy do buforu hybrydyzacji sondy.
      1. Użyj 1,2 μl sondy 1 μM, aby przygotować 300 μl materiału roboczego.
   4. Usuń roztwór do prehybrydyzacji i przenieś szkiełka nakrywkowe do wilgotnej komory.
      1. Odpipetować 30-50 μl roztworu sondy na parafilm, aby utworzyć pojedyncze kropelki.
   5. Próbki należy inkubować przez noc (12–18 godzin) w temperaturze 37 °C.

DZIEŃ 2

1. Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem do płytki 12-dołkowej i usunąć nadmiar roztworu sondy, przemłukując przez 4 x 5 minut 400 μl buforu do przemywania sondy w temperaturze 37 °C.
   nuta: Jako alternatywę dla umieszczania 30-50 μl podwielokrotności na parafolii i pod szkiełkami nakrywkowymi w celu inkubacji, należy dodać 300 μl roztworu sondy bezpośrednio do szkiełek nakrywkowych na płytce 12-dołkowej. Ta procedura jest prostsza, ale wymaga znacznych ilości odczynników. Przed użyciem podgrzej bufor do płukania sondy do temperatury 37 °C. Oblicz potrzebną ilość buforu i przenieś go do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
2. Myć próbki przez 2 x 5 minut za pomocą 5x SSCT w RT.
3. Zastąp 5 x roztwór SSCT 1 x PBS i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do czasu amplifikacji.

3. Wzmocnienie

1. Usunąć 1x roztwór PBS ze studzienek i dodać co najmniej 300 μl buforu amplifikacyjnego do każdego dołka. Próbki inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
2. Przygotuj każdą spinkę do włosów HCR (h1 i h2), schładzając zatrzaskowo żądaną objętość w oddzielnych probówkach.
   1. Aby przygotować 300 μl roztworu do amplifikacji, użyj 18 pmol każdej spinki do włosów (np. dla 300 μl użyj 6 μl 3 μM roztworu podstawowego spinki do włosów).
   2. Przenieś roztwór spinki do włosów do probówek.
   3. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 90 s.
   4. Schłodzić do RT przez 30 minut w ciemności.
3. Przygotuj mieszankę spinek do włosów, dodając schłodzone zatrzaskowo spinki do włosów "h1" i "h2" do bufora wzmacniającego.
4. Umieść krople 30-50 μl mieszanki spinek do włosów na parafolii.
5. Próbki należy inkubować przez noc (12-18 godzin) w ciemności w temperaturze pokojowej.

DZIEŃ 3

6. Przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem do płytki 12-dołkowej i usuń nadmiar spinek do włosów, myjąc przez 5 x 5 minut 5x SSCT w RT z mieszaniem.
7. Zassać 5x bufor SSCT i zastąpić go 1x PBS.
   nuta: W razie potrzeby należy użyć próbek RNA-FISH w standardowym teście immunofluorescencyjnym, a następnie wybarwić jądra (patrz punkt 1.4).

4. Barwienie jądrowe i montaż na suwaku

1. Odessać 1x roztwór PBS i zastąpić go 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, 0,2 μg / ml) w 1x roztworze PBS.
2. Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
3. Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
4. Umieścić dwie krople po 10 μl podłoża montażowego każda; upewnić się, że krople są wystarczająco oddzielone, aby umożliwić umieszczenie dwóch szkiełek nakrywkowych na jednym szkiełku.
5. Usuń nadmiar płynu, stukając w szkiełka nakrywkowe o czysty ręcznik, a następnie umieść je w podłożu montażowym zapobiegającym blaknięciu komórkami skierowanymi w dół.
6. Umieść zamontowane próbki na suchej, płaskiej powierzchni w ciemności i pozwól im się utwardzić.
7. Po utwardzeniu uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych uszczelniaczem VALAP lub lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu próbek.

2. SARS-CoV-2 RNA-FISH w kulturach HAE

DZIEŃ 1

1. Utrwalanie i przepuszczalność kultury HAE
   1. Odessać pożywkę i utrwalić zainfekowane komórki za pomocą 3,7% roztworu PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   2. Odessać 3,7% roztwór PFA i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
      1. Zastąp 3,7% roztwór PFA 1x PBS pod wkładką Transwell.
   3. Odrzucić PBS i odwodnić próbki, przemywając je 2 x 5 minut 100% MeOH schłodzonym do temperatury -20 °C.
   4. Po drugim płukaniu należy wymienić bufor na świeży, schłodzony MeOH w celu przepuszczalności pod wkładem Transwell. Przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.

DZIEŃ 2

2. Nawadnianie
   Ponownie uwodnić próbki za pomocą stopniowanej serii roztworów MeOH/PBST (każda przez 5 minut) na lodzie: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS i 100% PBST (dwukrotnie).
   1. Myj komórki przez 5 minut na lodzie z 50% 5x SSCT/50% PBST.
   2. Myć komórki przez 5 minut na lodzie za pomocą 5x SSCT.
   3. Zastąp bufor 5x SSCT na 1x PBS.
3. wykrywanie
   1. Inkubować komórki (wewnątrz wkładki Transwell) przez 5 minut na lodzie ze 100 μl buforu do hybrydyzacji sondy. Następnie przenieść płytkę do inkubatora na 30 minut w temperaturze 37 °C (prehybrydyzacja).
      nuta: Bufor do hybrydyzacji sondy musi być wstępnie podgrzany do temperatury 37 °C przed użyciem. Oblicz wymaganą objętość: 100 μl jest potrzebne na pojedynczą wkładkę Transwell.
   2. Przygotuj roztwór sondy. Ponieważ 1 ml roztworu sondy wymaga 4 pmol sondy, dodaj 4 μl 1 μM roztworu podstawowego sondy do 1 ml buforu hybrydyzacyjnego sondy i dobrze wymieszaj.
      nuta: Do wykrywania RNA użyj 100 μl roztworu sondy na wkładkę Transwell. Pozostaw roztwór sondy na lodzie do końca etapu prehybrydyzacji.
   3. Usuń roztwór prehybrydyzacyjny i dodaj roztwór sondy.
   4. Inkubować komórki przez noc (12-18 godzin) w temperaturze 37 °C.

DZIEŃ 3

5. Nadmiar sondy usunąć przez mycie przez 4 x 15 minut 100 μl buforu do płukania sondy w temperaturze 37 °C.
6. Myć próbki przez 2 x 5 minut za pomocą 5x SSCT w temperaturze pokojowej.
7. Zastąp 5x SSCT 1x PBS i przechowuj próbki w temperaturze 4 °C do czasu amplifikacji.

4. wzmocnienie

1. Wstępnie amplifikować próbki, inkubując je z buforem amplifikacyjnym przez 30 minut w temperaturze suchej tonacji.
2. Przygotuj każdą spinkę do włosów, schładzając zatrzaskowo żądane objętości w osobnych tubkach.
   1. Aby przygotować 500 μl roztworu do amplifikacji, użyj 30 pmol każdej spinki do włosów (np. dla 500 μl użyj 10 μl 3 μM roztworu podstawowego spinki do włosów).
   2. Przenieś roztwór spinki do włosów do rurek.
   3. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 90 s.
   4. Schłodzić do RT przez 30 minut w ciemności.
3. Przygotować roztwór spinki do włosów, dodając wszystkie schłodzone spinki do włosów schłodzone zatrzaskowo do 500 μl buforu wzmacniającego w temperaturze pokojowej.
4. Usuń roztwór do wstępnego amplifikacji i dodaj kompletny roztwór spinki do włosów.
5. Próbki należy inkubować przez noc (12-18 godzin) w temperaturze pokojowej w ciemności.
6. Usunąć nadmiar spinek do włosów, myjąc 5x SSCT w RT w następujący sposób: 2 x 5 min, 2 x 15 min i 1 x 5 min.
7. Zastąp 5x roztwór SSCT 1x PBS i przechowuj w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2-3 dni lub przejdź bezpośrednio do barwienia jądrowego.
   nuta: W razie potrzeby należy użyć próbek RNA-FISH w standardowym teście immunofluorescencyjnym, a następnie wybarwieniu jądrowym (patrz punkt 3).

5. Barwienie jądrowe i montaż na suwaku

1. Odessać 1x PBS roztwór i zastąpić go roztworem DAPI (0,2 μg/ml) w 1x PBS.
2. Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
3. Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
4. Umieść membranę wyciętą z wkładek Transwell na 10 μl podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu komórkami skierowanymi do góry i dodaj dodatkowe medium montażowe (5 μl) do membrany.
5. Przykryj membrany szkiełkami nakrywkowymi.
6. Zamontowane próbki należy utwardzać na suchej, płaskiej powierzchni w ciemności.
7. Po utwardzeniu uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych uszczelniaczem VALAP lub lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu próbek.

3. Analiza immunofluorescencyjna komórek Vero i hodowli HAE

UWAGA: Wykonaj test immunofluorescencyjny w dniu 3 dla linii komórkowych lub w dniu 4 dla kultur HAE. Dla każdego modelu należy zastosować inne podejście. Wszystkie różnice są wyraźnie wskazane.

1. Odessać 1x roztwór PBS ze studzienek.
2. Blokować próbki przez inkubację z 1% w/v albuminy surowicy bydlęcej w roztworze PBST przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
3. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe, przygotowując odpowiednie rozcieńczenia w roztworze blokującym, a następnie inkubować.
   1. Dla komórek Vero na szkiełkach nakrywkowych:
      1. Umieścić krople (30-50 μl) roztworu przeciwciał na parafilmie w komorze wilgotnościowej.
      2. Umieść szkiełka nakrywkowe na kroplach przeciwciał komórkami skierowanymi w dół.
   2. W przypadku HAE zastąpić środek blokujący w wkładkach roztworem przeciwciał (100 μl) i inkubować próbki w wilgotnej komorze.
      UWAGA: Dostosuj czas i temperaturę dla każdej inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Typowe parametry to 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Przemywać próbki PBST przez 3 x 5 minut.
   1. W przypadku komórek na szkiełkach nakrywkowych przenieść na płytkę 12-dołkową i dodać roztwór PBST.
   2. W przypadku posiewów HAE roztwór przeciwciał należy zastąpić roztworem PBST.
5. Sprawdź źródła światła i filtry dostępne dla mikroskopu konfokalnego.
6. Wybierz przeciwciała drugorzędowe w zależności od gatunku gospodarza. Wybierz parametry fluoroforu (długości fal wzbudzenia i emisji, szerokość widma i wydajność wzbudzenia w zależności od dostępnego źródła światła).
   nuta: Parametry spektralne można modelować za pomocą narzędzi online (patrz tabela materiałów).
7. Przygotuj odpowiednie roztwory przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczając je roztworem blokującym.
8. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (jak w ppkt 6.3), ale inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
9. Umyć próbki jak w kroku 3.4.
10. Barwienie jądrowe i montaż ślizgowy
    1. Do komórek na szkiełkach nakrywkowych
       1. Odessać PBST i zastąpić go DAPI (0,2 μg/ml) w roztworze 1x PBS.
       2. Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
       3. Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
       4. Umieścić szkiełka nakrywkowe na kroplach 10 μl podłoża montażowego komórkami skierowanymi w dół.
       5. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.
    2. Do kultur HAE
       1. Zassać 1x PBST i zastąpić go DAPI (0,2 μg/mL) w roztworze 1x PBS.
       2. Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
       3. Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
       4. Umieść wycięte membrany na kroplach 10 μl podłoża montażowego komórkami skierowanymi do góry i dodaj dodatkowe (5 μl) podłoża montażowego do membrany.
       5. Przykryj membrany szkiełkami nakrywkowymi.
       6. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.

4. Mikroskopia konfokalna

1. Zdefiniuj ścieżki, określając używane fluorofory.
2. Wybierz tryb i szybkość skanowania.
3. Dostosuj wartości mocy, wzmocnienia i przesunięcia lasera dla każdego fluoroforu, porównując je z odpowiednimi kontrolami negatywnymi: dla wirusa, pozorowane komórki; dla białek komórkowych, próbki barwione przeciwciałami kontrolnymi izotypu od odpowiedniego gospodarza.
4. Aby uzyskać obraz 3D, aktywuj tryb z-stack i ustaw górny i dolny limit. Ustaw rozmiar/liczbę kroku.
   nuta: Więcej informacji na temat obrazowania koronawirusa.