$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. SARS-CoV-2 RNA-FISH w komórkach Vero hodowanych na szkiełkach nakrywkowych
DZIEŃ 1
- Utrwalanie i przepuszczalnie komórek
- Napraw zainfekowane komórki za pomocą 3,7% w/v roztworu PFA przez 1 godzinę w RT.
- Odessać 3,7% roztwór PFA i dwukrotnie umyć komórki za pomocą 1x PBS.
- Przepuszczać komórki roztworem PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
- Odessać PBST i dwukrotnie umyć komórki 1x PBS.
- wykrywanie
- Odessać 1x roztwór PBS i dwukrotnie przemyć komórki 2x SSC w RT.
- Odessać 2x roztwór SSC i wstępnie zhybrydyzować próbki, dodając co najmniej 300 μl buforu do hybrydyzacji sondy. Przykryć studzienki zawierające komórki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Przygotować roztwór sondy, dodając 1,2 pmol mieszaniny sondy do buforu hybrydyzacji sondy.
- Użyj 1,2 μl sondy 1 μM, aby przygotować 300 μl materiału roboczego.
- Usuń roztwór do prehybrydyzacji i przenieś szkiełka nakrywkowe do wilgotnej komory.
- Odpipetować 30-50 μl roztworu sondy na parafilm, aby utworzyć pojedyncze kropelki.
- Próbki należy inkubować przez noc (12–18 godzin) w temperaturze 37 °C.
DZIEŃ 2
- Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem do płytki 12-dołkowej i usunąć nadmiar roztworu sondy, przemłukując przez 4 x 5 minut 400 μl buforu do przemywania sondy w temperaturze 37 °C.
nuta: Jako alternatywę dla umieszczania 30-50 μl podwielokrotności na parafolii i pod szkiełkami nakrywkowymi w celu inkubacji, należy dodać 300 μl roztworu sondy bezpośrednio do szkiełek nakrywkowych na płytce 12-dołkowej. Ta procedura jest prostsza, ale wymaga znacznych ilości odczynników. Przed użyciem podgrzej bufor do płukania sondy do temperatury 37 °C. Oblicz potrzebną ilość buforu i przenieś go do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Myć próbki przez 2 x 5 minut za pomocą 5x SSCT w RT.
- Zastąp 5 x roztwór SSCT 1 x PBS i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do czasu amplifikacji.
3. Wzmocnienie
- Usunąć 1x roztwór PBS ze studzienek i dodać co najmniej 300 μl buforu amplifikacyjnego do każdego dołka. Próbki inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Przygotuj każdą spinkę do włosów HCR (h1 i h2), schładzając zatrzaskowo żądaną objętość w oddzielnych probówkach.
- Aby przygotować 300 μl roztworu do amplifikacji, użyj 18 pmol każdej spinki do włosów (np. dla 300 μl użyj 6 μl 3 μM roztworu podstawowego spinki do włosów).
- Przenieś roztwór spinki do włosów do probówek.
- Inkubować w temperaturze 95 °C przez 90 s.
- Schłodzić do RT przez 30 minut w ciemności.
- Przygotuj mieszankę spinek do włosów, dodając schłodzone zatrzaskowo spinki do włosów "h1" i "h2" do bufora wzmacniającego.
- Umieść krople 30-50 μl mieszanki spinek do włosów na parafolii.
- Próbki należy inkubować przez noc (12-18 godzin) w ciemności w temperaturze pokojowej.
DZIEŃ 3
- Przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem do płytki 12-dołkowej i usuń nadmiar spinek do włosów, myjąc przez 5 x 5 minut 5x SSCT w RT z mieszaniem.
- Zassać 5x bufor SSCT i zastąpić go 1x PBS.
nuta: W razie potrzeby należy użyć próbek RNA-FISH w standardowym teście immunofluorescencyjnym, a następnie wybarwić jądra (patrz punkt 1.4).
4. Barwienie jądrowe i montaż na suwaku
- Odessać 1x roztwór PBS i zastąpić go 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, 0,2 μg / ml) w 1x roztworze PBS.
- Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
- Umieścić dwie krople po 10 μl podłoża montażowego każda; upewnić się, że krople są wystarczająco oddzielone, aby umożliwić umieszczenie dwóch szkiełek nakrywkowych na jednym szkiełku.
- Usuń nadmiar płynu, stukając w szkiełka nakrywkowe o czysty ręcznik, a następnie umieść je w podłożu montażowym zapobiegającym blaknięciu komórkami skierowanymi w dół.
- Umieść zamontowane próbki na suchej, płaskiej powierzchni w ciemności i pozwól im się utwardzić.
- Po utwardzeniu uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych uszczelniaczem VALAP lub lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu próbek.
2. SARS-CoV-2 RNA-FISH w kulturach HAE
DZIEŃ 1
- Utrwalanie i przepuszczalność kultury HAE
- Odessać pożywkę i utrwalić zainfekowane komórki za pomocą 3,7% roztworu PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Odessać 3,7% roztwór PFA i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
- Zastąp 3,7% roztwór PFA 1x PBS pod wkładką Transwell.
- Odrzucić PBS i odwodnić próbki, przemywając je 2 x 5 minut 100% MeOH schłodzonym do temperatury -20 °C.
- Po drugim płukaniu należy wymienić bufor na świeży, schłodzony MeOH w celu przepuszczalności pod wkładem Transwell. Przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.
DZIEŃ 2
- Nawadnianie
Ponownie uwodnić próbki za pomocą stopniowanej serii roztworów MeOH/PBST (każda przez 5 minut) na lodzie: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS i 100% PBST (dwukrotnie).
- Myj komórki przez 5 minut na lodzie z 50% 5x SSCT/50% PBST.
- Myć komórki przez 5 minut na lodzie za pomocą 5x SSCT.
- Zastąp bufor 5x SSCT na 1x PBS.
- wykrywanie
- Inkubować komórki (wewnątrz wkładki Transwell) przez 5 minut na lodzie ze 100 μl buforu do hybrydyzacji sondy. Następnie przenieść płytkę do inkubatora na 30 minut w temperaturze 37 °C (prehybrydyzacja).
nuta: Bufor do hybrydyzacji sondy musi być wstępnie podgrzany do temperatury 37 °C przed użyciem. Oblicz wymaganą objętość: 100 μl jest potrzebne na pojedynczą wkładkę Transwell.
- Przygotuj roztwór sondy. Ponieważ 1 ml roztworu sondy wymaga 4 pmol sondy, dodaj 4 μl 1 μM roztworu podstawowego sondy do 1 ml buforu hybrydyzacyjnego sondy i dobrze wymieszaj.
nuta: Do wykrywania RNA użyj 100 μl roztworu sondy na wkładkę Transwell. Pozostaw roztwór sondy na lodzie do końca etapu prehybrydyzacji.
- Usuń roztwór prehybrydyzacyjny i dodaj roztwór sondy.
- Inkubować komórki przez noc (12-18 godzin) w temperaturze 37 °C.
DZIEŃ 3
- Nadmiar sondy usunąć przez mycie przez 4 x 15 minut 100 μl buforu do płukania sondy w temperaturze 37 °C.
- Myć próbki przez 2 x 5 minut za pomocą 5x SSCT w temperaturze pokojowej.
- Zastąp 5x SSCT 1x PBS i przechowuj próbki w temperaturze 4 °C do czasu amplifikacji.
- wzmocnienie
- Wstępnie amplifikować próbki, inkubując je z buforem amplifikacyjnym przez 30 minut w temperaturze suchej tonacji.
- Przygotuj każdą spinkę do włosów, schładzając zatrzaskowo żądane objętości w osobnych tubkach.
- Aby przygotować 500 μl roztworu do amplifikacji, użyj 30 pmol każdej spinki do włosów (np. dla 500 μl użyj 10 μl 3 μM roztworu podstawowego spinki do włosów).
- Przenieś roztwór spinki do włosów do rurek.
- Inkubować w temperaturze 95 °C przez 90 s.
- Schłodzić do RT przez 30 minut w ciemności.
- Przygotować roztwór spinki do włosów, dodając wszystkie schłodzone spinki do włosów schłodzone zatrzaskowo do 500 μl buforu wzmacniającego w temperaturze pokojowej.
- Usuń roztwór do wstępnego amplifikacji i dodaj kompletny roztwór spinki do włosów.
- Próbki należy inkubować przez noc (12-18 godzin) w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Usunąć nadmiar spinek do włosów, myjąc 5x SSCT w RT w następujący sposób: 2 x 5 min, 2 x 15 min i 1 x 5 min.
- Zastąp 5x roztwór SSCT 1x PBS i przechowuj w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2-3 dni lub przejdź bezpośrednio do barwienia jądrowego.
nuta: W razie potrzeby należy użyć próbek RNA-FISH w standardowym teście immunofluorescencyjnym, a następnie wybarwieniu jądrowym (patrz punkt 3).
5. Barwienie jądrowe i montaż na suwaku
- Odessać 1x PBS roztwór i zastąpić go roztworem DAPI (0,2 μg/ml) w 1x PBS.
- Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
- Umieść membranę wyciętą z wkładek Transwell na 10 μl podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu komórkami skierowanymi do góry i dodaj dodatkowe medium montażowe (5 μl) do membrany.
- Przykryj membrany szkiełkami nakrywkowymi.
- Zamontowane próbki należy utwardzać na suchej, płaskiej powierzchni w ciemności.
- Po utwardzeniu uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych uszczelniaczem VALAP lub lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu próbek.
3. Analiza immunofluorescencyjna komórek Vero i hodowli HAE
UWAGA: Wykonaj test immunofluorescencyjny w dniu 3 dla linii komórkowych lub w dniu 4 dla kultur HAE. Dla każdego modelu należy zastosować inne podejście. Wszystkie różnice są wyraźnie wskazane.
- Odessać 1x roztwór PBS ze studzienek.
- Blokować próbki przez inkubację z 1% w/v albuminy surowicy bydlęcej w roztworze PBST przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe, przygotowując odpowiednie rozcieńczenia w roztworze blokującym, a następnie inkubować.
- Dla komórek Vero na szkiełkach nakrywkowych:
- Umieścić krople (30-50 μl) roztworu przeciwciał na parafilmie w komorze wilgotnościowej.
- Umieść szkiełka nakrywkowe na kroplach przeciwciał komórkami skierowanymi w dół.
- W przypadku HAE zastąpić środek blokujący w wkładkach roztworem przeciwciał (100 μl) i inkubować próbki w wilgotnej komorze.
UWAGA: Dostosuj czas i temperaturę dla każdej inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Typowe parametry to 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przemywać próbki PBST przez 3 x 5 minut.
- W przypadku komórek na szkiełkach nakrywkowych przenieść na płytkę 12-dołkową i dodać roztwór PBST.
- W przypadku posiewów HAE roztwór przeciwciał należy zastąpić roztworem PBST.
- Sprawdź źródła światła i filtry dostępne dla mikroskopu konfokalnego.
- Wybierz przeciwciała drugorzędowe w zależności od gatunku gospodarza. Wybierz parametry fluoroforu (długości fal wzbudzenia i emisji, szerokość widma i wydajność wzbudzenia w zależności od dostępnego źródła światła).
nuta: Parametry spektralne można modelować za pomocą narzędzi online (patrz tabela materiałów).
- Przygotuj odpowiednie roztwory przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczając je roztworem blokującym.
- Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (jak w ppkt 6.3), ale inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Umyć próbki jak w kroku 3.4.
- Barwienie jądrowe i montaż ślizgowy
- Do komórek na szkiełkach nakrywkowych
- Odessać PBST i zastąpić go DAPI (0,2 μg/ml) w roztworze 1x PBS.
- Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
- Umieścić szkiełka nakrywkowe na kroplach 10 μl podłoża montażowego komórkami skierowanymi w dół.
- Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.
- Do kultur HAE
- Zassać 1x PBST i zastąpić go DAPI (0,2 μg/mL) w roztworze 1x PBS.
- Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
- Umieść wycięte membrany na kroplach 10 μl podłoża montażowego komórkami skierowanymi do góry i dodaj dodatkowe (5 μl) podłoża montażowego do membrany.
- Przykryj membrany szkiełkami nakrywkowymi.
- Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.
4. Mikroskopia konfokalna
- Zdefiniuj ścieżki, określając używane fluorofory.
- Wybierz tryb i szybkość skanowania.
- Dostosuj wartości mocy, wzmocnienia i przesunięcia lasera dla każdego fluoroforu, porównując je z odpowiednimi kontrolami negatywnymi: dla wirusa, pozorowane komórki; dla białek komórkowych, próbki barwione przeciwciałami kontrolnymi izotypu od odpowiedniego gospodarza.
- Aby uzyskać obraz 3D, aktywuj tryb z-stack i ustaw górny i dolny limit. Ustaw rozmiar/liczbę kroku.
nuta: Więcej informacji na temat obrazowania koronawirusa.