Test mikroneutralizacji do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących w surowicy ludzkiej

Streszczenie

Źródło: Gross, F. L. et al., Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji przy użyciu komórek MDCK-SIAT1.J. Vis. Exp.(2017)

Ten film demonstruje testy mikroneutralizacji do pomiaru przeciwciał neutralizujących za pomocą komórek nerki Madin-Darby Canine nadekspresji kwasu sjalowego związanego z α2,6 w surowicy ludzkiej. Ten test jest często stosowany w badaniach serologicznych grypy u ludzi

Protokół

Wszystkie wirusy grypy powinny być traktowane zgodnie z odpowiednimi wymaganiami poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2 lub wyższym), zgodnie z definicją zawartą w Bezpieczeństwie Biologicznym w Laboratoriach Mikrobiologicznych i Biomedycznych (BMBL).

1. Przygotowanie odczynników i materiału wyjściowego

1. Przygotować komórki α2,6-sial transferazy mięsjalnej nerki psów (MDCK-SIAT1) i sterylne podłoże do hodowli komórek
   1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych MDCK-SIAT1 przy użyciu 500 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco z wysoką glukozą, 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 1 mg/ml siarczanu G418 (np. genetycyny) i 100 U/ml penicyliny ze 100 μg/ml streptomycyny (opcjonalnie). Sterylizować przez filtrację przez membranę o wielkości porów 0,2 μM. Siarczan G418 jest dodawany w celu zapewnienia stabilności plazmidu w komórkach MDCK-SIAT1.
   2. Przygotuj linię komórkową MDCK-SIAT1. W kolbie (kolbach) do hodowli tkankowych^o średnicy 162 cm, zawierającej 30 ml sterylnej pożywki do hodowli komórkowych, kolbach nasiennych z 2-2,5 x 10⁶ komórek MDCK-SIAT1 i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 2 dni; zostanie to wykorzystane do oznaczania dawki zakaźnej w hodowli tkankowej (TCID) i testów MN.
      nuta: Ogniwa MDCK-SIAT1 zostały dostarczone dzięki uprzejmości dr M. Matrosovicha z Marburga w Niemczech. Tę linię komórkową można również uzyskać komercyjnie (patrz tabela materiałów).
2. Przygotować sterylną pożywkę do namnażania wirusa, używając 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) frakcji V, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 20 mM kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES). Sterylizować przez filtrację przez membranę o wielkości porów 0,2 μM.
3. Przygotować 0,75% (v/v) krwinek czerwonych świnki morskiej (gpRBC) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) zawierającej 0,01 M PBS, przy pH 7,2.
4. Przygotuj sterylny rozcieńczalnik wirusa, używając DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 1% albuminy bydlęcej frakcji V (BSA), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 20 mM HEPES. Sterylizuj przez filtrację za pomocą membrany o wielkości porów 0,2 μm i przygotuj świeże do każdego testu.
5. Przygotować utrwalacz zimnych komórek jako 80% zimny aceton w PBS (0,01 M PBS, pH 7,2).
6. Przygotować bufor do płukania, używając PBS (0,01 M PBS pH 7,2) i 0,3% (v/v) tween-20.
7. Przygotować rozcieńczalnik przeciwciał przy użyciu PBS (0,01 M PBS, pH 7,2), 0,3% (v/v) tween-20 i 5% odtłuszczonego mleka w proszku.
8. Jako przeciwciało pierwszorzędowe należy użyć mysich klonów przeciwciał monoklonalnych A1 i A3 przeciwko grypie A NP. Rozcieńczyć w rozcieńczalniku przeciwciał w optymalnym stężeniu określonym przez miareczkowanie.
9. Użyj koziego anty-mysiego IgG sprzężonego z peroksydazą chrzanowa (HRP) jako przeciwciała drugorzędowego. Rozcieńczyć w rozcieńczalniku przeciwciał w optymalnym stężeniu określonym przez miareczkowanie.
10. Przygotować substrat peroksydazy przy użyciu dichlorowodorku o-fenylenodiaminy (OPD) w 0,05 M buforze cytrynianu fosforanowego o pH 5. Przygotować 0,05 M bufor cytrynianu fosforanu, rozpuszczając 1 kapsułkę/100 ml dejonizowanego_H2O. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić 1 tabletkę OPD (10 mg)/20 ml buforu cytrynianu fosforanu.
11. Użyj 0,5 M kwasu siarkowego jako roztworu zatrzymującego OPD. Dodać 28 ml 18 M bulionu kwasu siarkowego do 972 ml dejonizowanego_H2Ow kapturze chemicznym.
12. Leczenie surowic ludzkich i zwierzęcych
    1. Inaktywować termicznie surowice ludzkie stosowane w testach MN w łaźni wodnej w temperaturze 56 °C przez 30 minut przed badaniem. Zużyć natychmiast lub w razie potrzeby przechowywać rozmrożone surowice w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 24 godziny; jeżeli konieczny jest dłuższy okres przechowywania, surowice należy przechowywać zamrożone w temperaturze -20 °C lub niższej.
    2. Surowice zwierzęce stosowane w testach MN należy potraktować enzymem niszczącym receptor (RDE) i unieszkodliwić termicznie przed badaniem w następujący sposób.
       1. Rozmrozić surowice w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie umieścić na lodzie. Zmieszać 1 objętość próbki surowicy zwierzęcej z 3 objętościami RDE. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 18-20 godzin.
       2. Inaktywować termicznie surowice poddane działaniu RDE w temperaturze 56 °C przez 30 minut. Dodać 6 objętości PBS o pH 7,2 do każdej próbki w celu końcowego rozcieńczenia wstępnego w stosunku 1:10. W razie potrzeby rozmrożone surowice należy przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 24 godziny; jeżeli konieczne jest dłuższe przechowywanie, należy przechowywać surowice zamrożone w temperaturze -20 °C lub niższej.
          nuta: Surowice zwierzęce mogą zawierać różne glikany kwasu sjalowego, które mogą wiązać się z hemaglutyninami lub kwasami hialuronowymi wirusów grypy i hamować wiązanie przeciwciał anty-HA specyficznych dla grypy. W związku z tym konieczne jest poddanie RDE działaniu wszystkich surowic zwierzęcych przed testami MN w celu usunięcia tych niespecyficznych wirusowych spoiw kwasu hialuronowego z próbek surowicy.

2. Przejście hodowli komórkowej MDCK-SIAT1

UWAGA: Wszystkie hodowle komórkowe muszą być przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapobiec skażeniu.

1. Zdekantować pożywkę do hodowli komórkowych z monowarstwy komórek w kolbach o długości 162 cm2. Trypsynizuj komórki, przepłukując monowarstwę kwasem trypsyna-etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Dodaj 5 ml trypsyny-EDTA, aby pokryć monowarstwę komórki. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% dwutlenku węgla, CO₂ aż do oderwania monowarstwy (5-10 min). Dodać 15 ml pożywki do hodowli komórkowych MDCK-SIAT1 do każdej kolby zawierającej trypsynizowane komórki i pipetować w górę i w dół, aby oddzielić komórki.
2. Użyj hemocytometru i trypana niebieskiego, aby określić liczbę komórek i żywotność. Wysiewać komórki w nowych kolbach do hodowli tkankowych o długości 162^cm2 zawierających 30 ml pożywki do hodowli komórkowych z 2-2,5 x 10⁶ komórek / kolbę i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 2 dni do stosowania w testach TCID i MN. Komórki nasienne w 4 - 5 x 10^{6 komórek}/kolbę i inkubować w temperaturze 37°C z 5% CO₂ przez 2 dni do wykorzystania w rozmnażaniu wirusa.
   nuta: Gęstość siewu można regulować, jeśli pożądane są krótsze lub dłuższe okresy hodowli. Do namnażania się wirusa komórki powinny osiągnąć ponad 100% konfluencji. W przypadku testów dawki zakażenia kulturą tkankową (TCID) i testów MN komórki powinny znajdować się w 75-95% zbiegu (ryc. 1).

3. Rozprzestrzenianie się wirusów A(H3N2) w komórkach MDCK-SIAT1

UWAGA: Wirus A(H3N2) może być rozmnażany zarówno w 10 - 11-dniowych zarodkach kurzych jaj zgodnie ze standardowym protokołem, jak i w hodowlach komórkowych MDCK-SIAT1. Komórki MDCK-SIAT1 powinny osiągnąć ponad 100% konfluencję do inokulacji wirusa. Zapasy nasion wirusa można inokulować wielokrotnymi rozcieńczeniami inokulum. Rozcieńczenia inokulum o najlepszym poziomie HA i zakaźności mogą być wykorzystane do dalszych testów MN.

1. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z monowarstwy komórek (>100% zbieżności) w kolbach^o długości 162 cm2. Umyj monowarstwę dwukrotnie 15 ml sterylnego 0,01 M PBS o pH 7,2 i zdekantuj.
2. Oznaczyć 1 kolbę jako kontrolną i dodać 20 ml pożywki do namnażania wirusa. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Pozostawić tę kolbę nietkniętą i użyć jej do porównania po 1 dniu namnażania się wirusa.
3. Dodać 10 ml sterylnej pożywki do rozmnażania wirusa do kolby(-i) i inkubować wszystkie kolby(-e) w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Rozmrozić fiolkę z zapasem wirusa grypy w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić na lodzie. Rozcieńczyć pożywką do rozmnażania wirusa do docelowych rozcieńczeń.
   nuta: Docelowe rozcieńczenia można dostosować w oparciu o miana kwasu hialuronowego w zasobach wirusa. Aby przygotować inokulum rozcieńczone w stosunku 1:1000, dodaj 100 μl wirusa do 9,9 ml sterylnego podłoża do namnażania wirusa. Delikatnie odwrócić, usunąć 1 ml rozcieńczenia 1:100 do 9 ml sterylnego podłoża do namnażania wirusa i delikatnie odwrócić, aby uzyskać inokulum rozcieńczone w stosunku 1:1000. Ułóż na lodzie.
4. Wyjąć z inkubatora wszystkie kolby z wyjątkiem kolby kontrolnej. Usunąć pożywkę do namnażania wirusa z kolby(-i) komórek MDCK-SIAT1 i zaszczepić każdą kolbę 10 ml rozcieńczonego wirusa. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 1 godzinę, obracając kolbę (kolby) co 15 minut.
5. Usunąć 5 ml inokulum z kolby(-i) i zastąpić 15 ml pożywki do rozmnażania wirusa zawierającej 1 μg/ml trypsyny poddanej działaniu tosylofenyloalanylu chlorometyloketyki (trypsyna TPCK). Inkubować kolbę(-i) w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 16-18 godzin.
6. Po całonocnej inkubacji obserwuj kolbę (kolby) pod 100-krotnym powiększeniem mikroskopu i poszukaj wpływu cytopatycznego (CPE) na komórki. Usunąć 15-17 ml supernatantu wirusa z kolby(-i) i zastąpić go 15-17 ml świeżo przygotowanej pożywki do namnażania wirusa zawierającej 2 μg/ml TPCK-trypsyny.
7. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Monitorować CPE monowarstwy (w porównaniu z kolbą kontrolną komórki) i okresowo sprawdzać HA (co 4 godziny) za pomocą 0,75% gpRBC aż do zbioru.
   1. Ustawić HA 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania. Dodać 50 μl 0,01 M PBS o pH 7,2 do studzienek A2 - A12 i B2 - B12 (duplikaty) oraz studzienek H1 - H12 do kontroli.
   2. Dodać 100 μl supernatantu wirusa do A1 i A2 i przeprowadzić 2-krotne seryjne rozcieńczenie od A1 i B1 przez A12 i B12. Wyrzucić 50 μl po zmieszaniu z A12 i B12. Dodaj 50 μl 0,75% gpRBC do rzędów A, B i H.
   3. Postukaj w płytkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
      1. Oznaczyć kwas hialuronowy supernatantu wirusa, przechylając 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania pod kątem od 45° do 60°.
      2. Odczyt płytek do hemaglutynacji; najwyższe rozcieńczenie wirusa, które osiąga pełną hemaglutynację, jest uważane za punkt końcowy miareczkowania HA dla określonego wirusa. Zapisać odwrotność największego rozcieńczenia wirusa z całkowitą hemaglutynacją jako miano kwasu hialuronowego wirusa.
         nuta: Osiadłe erytrocyty w rzędzie H (kontrole) powinny zacząć "biegać" i pod wpływem grawitacji uformować mały kształt łzy. Poczekaj, aż RBC w studzienkach kontrolnych zakończą pracę, a następnie odczytaj przyciski RBC w studzienkach miareczkowania wirusa. Te, które mają guziki RBC i "biegają", nie osiągają hemaglutynacji. Zlokalizuj najwyższe rozcieńczenie wirusa, które całkowicie hamuje hemaglutynację, jako końcowe miano kwasu hialuronowego wirusa.
8. Wirusa należy zebrać, gdy kwas hialuronowy w kulturze wirusa ustabilizuje się lub kultura wirusa osiągnie docelowy kwas hialuronowy (na przykład >16 jednostka kwasu hialuronowego), ale zanim monowarstwa komórki zacznie wykazywać znaczne CPE.
   1. Odwirować supernatant kultury wirusa o stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórkowych. Przenieść sklarowany supernatant zawierający zebrany wirus do czystej probówki. Porcjować supernatant zawierający wirusa do sterylnych fiolek kriogenicznych jednorazowego użytku i natychmiast zamrażać w temperaturze -70 °C lub niższej.
      nuta: Zapasy wirusa używane do testów MN powinny mieć wysokie miano zakaźne i minimalną ilość wadliwych cząstek. Minimalne rozcieńczenie zapasów wirusa w celu osiągnięcia 100 TCID₅₀/50 μL dla testu MN wynosi 1:100.
      nuta: Zapasy wirusa użyte w testach MN nie powinny być rozmrażane i ponownie zamrażane.

4. Określenie TCID wirusa

1. Dzień 1: Miareczkowanie wirusa
   1. Rozmrozić fiolkę z wirusem w temperaturze pokojowej i natychmiast umieścić ją na lodzie.
   2. Przetestuj wirusa w dwóch różnych rozcieńczeniach początkowych: ^10-2 i ^10-3. Dodać 100 μl wirusa do 9,9 ml rozcieńczalnika do wirusów w rozcieńczeniu ^10-2. Dodać 1 ml rozcieńczalnika ^10-2 do 9,0 ml rozcieńczalnika wirusa w celu rozcieńczenia ^10-3.
   3. Używając dwóch płytek do mikromiareczkowania (płytki 1 do rozcieńczenia ^10-2 i płytki 2 do rozcieńczenia ^10-3), dodać 100 μl rozcieńczalnika wirusa do wszystkich studzienek z wyjątkiem kolumny 1 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.
   4. Wykonaj 1/2log₁₀ rozcieńczeń (^10-2, ^10-2,5, ^10-3 itd.). Dodać 146 μl wirusa, zaczynając od rozcieńczenia, do wszystkich studzienek w kolumnie 1 i przenieść szeregowo 46 μl z kolumny 1 do kolumny 11 (rysunek 2). Wymieniaj końcówki pipet między dołkami. Po wymieszaniu kolumny 11 wyrzucić końcówki rozcieńczone 46 μl.
   5. Kolumnę 12 należy stosować jako kolumnę kontrolną (CC); zawiera ona tylko rozcieńczalnik wirusa. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .}
2. Dzień 1: Przygotowanie komórek MDCK-SIAT1
   nuta: Monowarstwa komórek MDCK-SIAT1 powinna osiągnąć zbieg 75 - 95% dla testów TCID i MN. Jedna kolba o średnicy 162^cm2 przy 95% zbiegu powinna dać wystarczającą ilość komórek do zasiania ~ 4 - 5 płytek do mikromiareczkowania.
   1. Przemyć 75 - 95% zlewającą się monowarstwę 20 ml PBS, aby usunąć FBS z pożywki hodowlanej. Trypsynizuj komórki w następujący sposób.
      1. Przepłucz monowarstwę sterylnym PBS i dodaj 7 ml trypsyny-EDTA, aby pokryć monowarstwę komórek. Ułożyć kolbę płasko i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ aż do oderwania się monowarstwy (około 5-10 min). Dodać 7 ml rozcieńczalnika do wirusa do każdej kolby zawierającej trypsynizowane komórki.
   2. Umyj komórki rozcieńczalnikiem do wirusów, aby usunąć FBS.
      1. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozdzielić komórki. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml; Napełnij probówkę rozcieńczalnikiem do wirusów.
      2. Odwirować przy 485 x g przez 5 minut. Zdekantować rozcieńczalnik do wirusa, zastąpić go świeżym rozcieńczalnikiem do wirusa o pojemności 50 ml i odwirować przy 485 x g przez 5 minut. Zdekantować rozcieńczalnik wirusa i zastąpić go świeżym rozcieńczalnikiem do wirusów (10 ml/kolbę) w celu ponownego zawieszenia osadu.
   3. Użyj hemocytometru i błękitu trypanowego, aby określić liczbę komórek i żywotność. Dostosuj stężenie komórek za pomocą rozcieńczalnika wirusa do 1,5 x 10⁵ komórek/ml.
   4. Dodać 100 μl rozcieńczonych komórek MDCK-SIAT1 do każdego dołka z płytek do mikromiareczkowania (1,5 x 10⁴ komórki/basenik) i przykryć płytki. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 18 - 20 godzin.
3. Dzień 2: Test ELISA
   1. Utrwalanie komórek
      1. Usunąć pożywkę z płytek do mikromiareczkowania. Umyj każdą studzienkę 200 μl PBS. Do każdej studzienki dodać 300 μl zimnego 80% acetonu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usuń utrwalacz i pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu.
   2. Elisa
      1. Pierwszorzędowe dodawanie przeciwciał
         nuta: Przeciwciało monoklonalne NP przeciwko grypie A powinno być stosowane w nadmiarze jako przeciwciało pierwszorzędowe w teście ELISA. Określić optymalne rozcieńczenie przeciwciał dla każdej partii przeciwciał pierwszorzędowych, wykonując miareczkowanie przeciwciał w MN. Wybierz pierwszorzędowe stężenie przeciwciała, które jest nadmierne i ma najlepszy stosunek sygnału do tła.
         1. Rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne NP przeciw grypie A (przeciwciało pierwszorzędowe) do stężenia docelowego w rozcieńczalniku przeciwciała (np. dodać 30 μl przeciwciała pierwszorzędowego do 30 ml rozcieńczalnika przeciwciała w celu uzyskania docelowego rozcieńczalnika 1:1000).
         2. Umyj płytki 3 razy 300 μl buforu do mycia. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
      2. Wtórna addycja przeciwciał
         UWAGA: Kozia immunoglobulina przeciw myszy, IgG sprzężona z peroksydazą chrzanową (HRP) powinna być stosowana w nadmiarze jako przeciwciało drugorzędowe w teście ELISA. Określić optymalne rozcieńczenie przeciwciał dla każdej partii przeciwciał drugorzędowych, wykonując miareczkowanie przeciwciał. Wybierz stężenie przeciwciał drugorzędowych w nadmiarze i z najlepszym stosunkiem sygnału do tła.
         1. Rozcieńczyć kozią anty-mysią IgG sprzężoną z przeciwciałem HRP (przeciwciało drugorzędowe) do stężenia docelowego w rozcieńczalniku przeciwciała (np. Dodać 7,5 μl przeciwciała drugorzędowego do 30 ml rozcieńczalnika przeciwciała dla docelowego rozcieńczenia 1:4000).
         2. Umyj płytki 3 razy 300 μl buforem do mycia. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
      3. Dodawanie substratu i odczyt płytki
         1. Umyj płytki 5 razy buforem myjącym o pojemności 300 μl i postukaj w niestrzępiącą się chusteczkę.
         2. Dodać 100 μl świeżo przygotowanego substratu do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej, aż rozwój koloru się nasyci, a gęstość optyczna (OD) studzienek kontrolnych komórek <0,2.
         3. Dodać 100 μl roztworu zatrzymującego do wszystkich studzienek. Odczytać średnicę zewnętrzną studzienek przy długości fali 490 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego.
4. Obliczanie identyfikatora TCID ₅₀
   1. Obliczyć medianę OD₄₉₀ kontrolek komórek (kolumna 12).
   2. Każdą studzienkę testową o OD₄₉₀ większą niż dwukrotność mediany OD₄₉₀ studzienek CC należy uznać za "pozytywną"; w przeciwnym razie uznaje się ją za "ujemną".
   3. Oblicz TCID₅₀ wirusa za pomocą metody Reeda-Muencha.
      1. Określić liczbę dodatnich i ujemnych wartości przy każdym rozcieńczeniu.
      2. Obliczyć "skumulowaną wartość dodatnią", "skumulowaną ujemną", "Stosunek" i "% dodatni", jak pokazano w tabeli 1.
      3. Obliczyć "proporcjonalną odległość" między rozcieńczeniem wykazującym >50% dodatnim a rozcieńczeniem wykazującym <50% dodatnim, stosując następujące metody:
         
         nuta: Współczynnik korygujący dla rozcieńczenia 1/2 log wynosi 0,5. Na przykład w tabeli 1: (80 − 50)/(80 − 20) x 0,5 = 0,25
      4. Obliczyć TCID_{wirusa 50}, dodając proporcjonalną odległość do rozcieńczenia, które > 50% dodatnie.
         nuta: Na przykład w tabeli 2 identyfikator TCID₅₀ to 10-5^+(-0,25) = 10-5,25. UWAGA: jest to TCID₅₀ wirusa na 100 μL (lub ^10-5,25/100 μL).
   4. Obliczyć rozcieńczenie wirusa. W przypadku testów MN rozcieńczyć wirusa do 200 TCID₅₀/100 μL (co odpowiada 100 TCID₅₀/50 μL na studzienkę).
      nuta: W przykładzie w tabeli 1 1 TCID₅₀ wynosi 10-5,25 w 100 μl, a rozcieńczenie w celu osiągnięcia 200 TCID₅₀/100 μL wynosi 1:891 na podstawie obliczeń: 200 x ^10-5,25 = ^10-2,95 = 1/10^2,95 = 1/891

5. Test MN przy użyciu komórek MDCK-SIAT1

1. Dzień 1: Przygotowanie surowic testowych i kontrolnych oraz układ płytek
   1. Rozmrozić surowice w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i usunąć natychmiast po rozmrożeniu. Podwielokrotność ilości surowic, która musi zostać poddana badaniu; do przeprowadzenia testu na obecność jednego wirusa w singlecie potrzeba co najmniej 10 μl oryginalnej surowicy. Jeśli to możliwe, przetestuj surowice w duplikatach.
   2. Ogrzewać surowice ludzkie przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C, jak w kroku 1.12.1. Umieścić surowice na lodzie po inaktywacji termicznej i dodać rozcieńczalnik wirusa do surowicy, aby uzyskać wstępne rozcieńczenie 1:10.
   3. RDE poddać działaniu i wstępnie rozcieńczyć surowice zwierzęce w stosunku 1:10 do użycia do kontroli zgodnie z 1.12.2.
      nuta: Rozmrożone i poddane działaniu substancji surowice ludzkie i zwierzęce mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 24 godziny. Surowice należy przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C lub niższej, jeżeli przed badaniem konieczny jest dłuższy okres przechowywania.
   4. Aby przeprowadzić test z użyciem jednego wirusa, dodaj 100 μl surowicy rozcieńczonej w stosunku 1:10 do kolumn od A1 do A10 (ryc. 3). Dodać 50 μl rozcieńczalnika do wirusa do rzędów od B do H, z wyjątkiem kolumn 11 i 12 (ryc. 3). Wykonać 2-krotne rozcieńczenie seryjne od rzędów A do H i wyrzucić ostatnie 50 μl w rzędzie H (Rysunek 3).
      nuta: W przypadku badania na obecność wielu wirusów, surowice można rozcieńczyć w probówkach z mianem. Rozcieńczenie surowicy w celu określenia miana surowicy w studzience A wynosi 1:10, studnia B 1:20, studnia C 1:40, studnia D 1:80, studnia E 1:160, studnia F 1:320, studnia G 1:640, studnia H 1:1,280 (ryc. 3).
   5. W celu zwalczania wirusa dodać 50 μl rozcieńczalnika wirusa do studzienek A12, B12, C12 i D12 (bez surowic). W celu kontroli komórki dodać 100 μl rozcieńczalnika wirusa do studzienek E12, F12, G12 i H12 (bez wirusa, bez surowic).
   6. W przypadku surowic kontrolnych (na przykład kontrolnych surowic fretek) dodać 100 μl rozcieńczonych surowic kontrolnych do basenika A kolumny 11 i dodać 50 μl rozcieńczalnika wirusa do baseników B11 - H11. Szeregowo rozcieńczyć w dół.
   7. Przykryć płytki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ do momentu przygotowania do dodania wirusa.
2. Dzień 1: Dodanie wirusa
   1. Rozcieńczyć wirusa do 100 TCID₅₀/50 μl rozcieńczalnikiem do wirusów.
   2. Dodać 50 μl rozcieńczonego wirusa do wszystkich studzienek, z wyjątkiem kolumny 11 na płytkach do miareczkowania wstecznego (BT) i studzienek kontrolnych E12, F12, G12 i H12 na wszystkich płytkach (ryc. 3). W przypadku płytek z surowicami kontrolnymi w kolumnie 11 dodać wirusa do kolumny 11.
   3. Miareczkowanie wsteczne (BT)
      1. Umieść BT w kolumnie 11 jednego zestawu zduplikowanych tablic rejestracyjnych (na przykład tablic 1A i 1B). Dodać 50 μl rozcieńczalnika wirusa do wszystkich studzienek w kolumnie 11. Dodać 50 μl wirusa o stężeniu 100 TCID₅₀/50 μl do pierwszego dołka (A11). Mieszać, pipetując w górę i w dół.
      2. Wymieszać i przenieść 50 μl do kolejnych studzienek, aby wykonać 2-krotne seryjne rozcieńczenia. Wymieniaj końcówki pipet między studzienkami, aby uniknąć przenoszenia wirusa. Wyrzucić 50 μl z dołka H11.
      3. Dodać 50 μl rozcieńczalnika do wirusa do kolumny 11, aby doprowadzić końcową objętość do 100 μl. Postukać w płytki, aby wymieszać.
   4. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 1 godzinę.
   5. Wykonaj dodawanie komórek MDCK-SIAT1 w dniu 1 i ELISA w dniu 2, zgodnie z opisem w krokach 4.2 i 4.3 (opisanym również w 5.3 i 5.4)
3. Dzień 1: Dodanie komórek MDCK-SIAT1
   1. Przygotuj komórki MDCK-SIAT1 zgodnie z opisem w kroku 4.2. Dodaj 100 μl komórek MDCK-SIAT1 przy 1,5 x 10⁵ komórek/ml do każdej studzienki (1,5 x 10⁴ komórki/studzienkę). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 18 - 20 godzin.
4. Dzień 2: Test ELISA
   1. Po całonocnej inkubacji, drugiego dnia, utrwal komórki 80% zimnym acetonem, jak opisano w kroku 4.3.
   2. Dodanie przeciwciał pierwotnych
      1. Umyj płytki 3 razy 300 μl buforem do mycia. Rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne NP przeciw grypie A (przeciwciało pierwszorzędowe) do optymalnego stężenia określonego przez miareczkowanie w rozcieńczalniku przeciwciał (np. dodać 30 μl przeciwciała pierwszorzędowego do 30 ml rozcieńczalnika przeciwciała w celu uzyskania docelowego rozcieńczalnika 1:1000).
         UWAGA: Wymagane jest 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego na studzienkę. Na płytkę potrzeba ~10 ml.
      2. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   3. Wtórne dodawanie przeciwciał
      1. Umyj płytki 3 razy buforem myjącym o pojemności 300 μl. Rozcieńczyć kozią anty-mysią IgG sprzężoną z przeciwciałem HRP (przeciwciało drugorzędowe) do stężenia docelowego w rozcieńczalniku przeciwciała (np. Dodać 7,5 μl przeciwciała drugorzędowego do 30 ml rozcieńczalnika przeciwciała dla celu 1:4000).
         UWAGA: Wymagane jest 100 μl przeciwciał drugorzędowych na 96 dołków. Na płytkę potrzeba ~10 ml.
      2. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   4. Dodawanie substratu i odczyt płytki
      1. Umyj płytki 5 razy buforem myjącym o pojemności 300 μl i postukaj w niestrzępiącą się chusteczkę.
      2. Dodać 100 μl świeżo przygotowanego substratu do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej, aż studzienki kontrolne wirusa osiągną OD₄₉₀ = 0,8 - 3, przy kontroli komórek przy niskim tle OD₄₉₀ <0,2.
      3. Dodać 100 μl roztworu zatrzymującego do wszystkich studzienek. Odczytać średnicę zewnętrzną studzienek przy długości fali 490 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego.
5. Analiza danych
   nuta: Obliczenia MN są ustalane indywidualnie dla każdej płyty.
   1. Oznaczyć miano przeciwciał neutralizujących w każdej próbce surowicy.
      1. Obliczyć wartość graniczną OD₄₉₀ dla 50% neutralizacji wirusa dla każdej płytki, korzystając z następującego równania:
         
         nuta: Tutaj x = 50% granicy neutralizacji. Wzajemne rozcieńczenie surowicy odpowiadające najwyższemu rozcieńczeniu OD₄₉₀ mniej niż 50% wartości odcięcia (≥50% inhibicji) uważa się za miano przeciwciała neutralizującego dla tej próbki surowicy (ryc. 4).
   2. Sprawdź, czy studzienki kontrolne komórek mają OD₄₉₀ <0,2, a studzienki kontroli wirusów mają OD₄₉₀ = 0,8 - 3.
   3. Sprawdź zakaźność wirusa w każdym teście (100x TCID₅₀) za pomocą wirusa BT. Dopuszczalny zakres BT to 50, 100 lub 200 TCID. W przypadku stosowania tego samego punktu odcięcia, jak określono w kroku 4.4.2, najwyższe rozcieńczenie wirusa w kolumnie BT z OD powyżej granicy powinno mieć miejsce w studzienkach E11, F11 i G11.
      nuta: Kontrole dodatnie surowicy powinny dawać miana w granicach 2-krotności wartości uzyskanych w poprzednich badaniach. OD₄₉₀ ujemnej kontroli surowicy powinien być podobny do obserwowanego dla kontroli wirusa.

Wyniki

Rysunek 1. Hodowla komórkowa MDCK-SIAT1.Ogniwa MDCK-SIAT1. (A) zlewająca się jednowarstwa MDCK-SIAT1 (>100% zbiegu) do inokulacji wirusa; (B) Komórki MDCK-SIAT1 w fazie logarytmicznej z konfluencją 75 - 95% dla testów TCID₅₀ i MN.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy	Nauki przyrodnicze	Numer katalogowy 11965	Kluczowy składnik sterylnych hodowli komórkowych, namnażania wirusów i pożywek rozcieńczalników wirusów
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Klon	SH30070.03
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) frakcja V, wolna od protazy	Sigma-Aldrich	3117332001
L-glutamina	Nauki przyrodnicze	25030-081
Pirogronian sodu	Nauki przyrodnicze	Numer katalogowy: 11360-070
Sól dwusiarczanowa Geneticin G-418	Sigma-Aldrich	A1720-5G
HEPESY	Nauki przyrodnicze	Numer katalogowy: 15630-080
Penicylina/Streptomycyna	Nauki przyrodnicze	Rozdział 15140-122
aceton	Firma VWR	67-64-1	Stosowany w stężeniu 80%
Bufor fosforanowo-cytrynianowy z nadboranem sodu	Sigma-Aldrich	SLBF2806V
Tabletka dichlorowodorku O-fenylenodiaminy	Sigma-Aldrich	SLBQ1086V	1 tabletka na 100 ml wody klasy do hodowli komórkowych
kwas siarkowy	Fisher Naukowy	A510-P500	Używane stężenie końcowe 0,5 M
Etanol, denaturowany, 4L	Firma VWR	EM-AX0422-3	Stosowany w stężeniu 70%
Trypsyna-EDTA	Nauki przyrodnicze	1748048
RDE II "Seiken"	Denka Seiken	370013
Animacja 20	Sigma-Aldrich	P1379-500ml
Mysz monoklonalna anty-NP Ab	Basen Millipore	MAB 8257 MAB 8258
Przeciw mysim IgG HRP	KPL (Polskie Biuro	074-1802
96-dołkowe płytki z płaskim dnem	Thermo Scientific	3455
Czytnik płytek	Urządzenie molekularne	Spectromax 384 plus
Kolba do hodowli komórkowych 162 cm2/Nasadka wentylacyjna	Corning/VWR	Numer katalogowy: 3151

Prasowe okrążenie Oczko