Test do wykrywania wybuchu oksydacyjnego w krążkach liści Arabidopsis po wywołaniu immunologicznym

Streszczenie

Źródło: Bredow, M., et al. Testy oksydacyjnego wybuchu i zahamowania wzrostu sadzonek wywołane wzorcem u Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film pokazuje test do pomiaru wybuchu oksydacyjnego w liściach Arabidopsis po wywołaniu odporności. Krążki liściowe, wycięte z liści roślin, są inkubowane z peptydami bakteryjnymi działającymi jako wzorce molekularne związane z drobnoustrojami lub MAMP. Po wykryciu MAMP komórki roślinne indukują produkcję zewnątrzkomórkowego ROS, który jest wykrywany za pomocą testu chemiluminescencyjnego.

Protokół

1. Wykrywanie pęku ROS w krążkach liściowych Arabidopsis po wywołaniu immunologicznym

1. Wzrost i pielęgnacja roślin.
   1. Aby zsynchronizować kiełkowanie, stratyfikuj nasiona Arabidopsis, zawieszając około 50 nasion w 1 ml sterylnego 0,1% agaru [w/v] i przechowuj w temperaturze 4 °C (bez światła) przez 3-4 dni.
      nuta: Stratyfikacja kontroli tła typu dzikiego (na przykład Col-0) i genotypów o wysokiej i niskiej odporności (na przykład odpowiednio cpk28-1 i bak1-5), aby służyły jako kontrole wewnętrzne.
   2. Wysiewaj nasiona na glebie i kiełkuj w standardowych warunkach dnia krótkiego (22 °C, 10 h światła, natężenie światła 150 μE/^{m 2}/s i wilgotność względna 65-70%).
   3. Po około 7 dniach za pomocą kleszczy przesadz pojedyncze sadzonki do nowych doniczek, oddalonych od siebie o co najmniej 4 cm, aby umożliwić pełny rozwój rozety. Przeszczep 6-12 sadzonek na genotyp i wróć do standardowych warunków dnia krótkiego. Regularnie podlewaj i nawozij rośliny (1 g/l 20-20-20 nawozu co 2 tygodnie).
2. Zbierz krążki liściowe na 96-dołkowych płytkach w celu odzyskania przez noc.
   1. Po 4-5 tygodniach od wykiełkowania (ryc. 1A) użyj ostrego stempla biopsyjnego o średnicy 4 mm, aby usunąć jeden krążek liściowy na roślinę, omijając środkową żyłę i uważając, aby ograniczyć zranienia (ryc. 1B). Umieść krążki liściowe w nieużywanej 96-dołkowej płytce luminometru zawierającej 100 μl podwójnie destylowanej wody (ddH₂O) stroną adaksjalną skierowaną do góry, aby zapobiec wysuszeniu (rysunek 1C). W przypadku oceny wielu elicytorów należy usunąć 1 krążek liściowy z tego samego liścia na każdy zabieg elicytorowy.
      nuta: Próbka liści, która jest w pełni rozwinięta, od trzeciej do piątej od szczytu rozety i mniej więcej tej samej wielkości i wieku, aby ograniczyć zmienność. Jeśli to możliwe, przed nocnym rekonwalescencją przeciąć krążki liściowe na pół za pomocą żyletki, ponieważ zwiększa to powierzchnię narażoną na działanie roztworu elicytora.
   2. Regenerować przez noc w temperaturze pokojowej, aby zapobiec interferencji ROS powstałej w wyniku zranienia podczas zbierania krążka liściowego. Przykryj talerze pokrywką, aby zapobiec parowaniu.
3. Wykonaj zabieg elicytorowy i zmierz produkcję ROS.
   1. Zaprogramuj czytnik płytek przed dodaniem roztworu reakcyjnego, ponieważ skróci to czas między inicjacją impulsu ROS a pierwszymi zarejestrowanymi pomiarami. Użyj komercyjnego oprogramowania, które jest odpowiednie dla czytnika płytek. W naszym przypadku (patrz Spis treści) kliknij Ustawienia i wybierz wkładkę LUM96 i typ odczytu kinetycznego. Kliknij kategorię Obszar odczytu i przeciągnij, aby wybrać podzbiór studni lub całą płytę do odczytu. W zakładce PMT i Optyka ustaw czas integracji na 1 000 ms. Na karcie Timing (Czas) ustaw Całkowity czas pracy na 40-60 min i Interwał na 2 min.
   2. Usuń wodę z każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.
      nuta: Nie należy nakłuwać talerzy liściowych, ponieważ może to spowodować naprężenia raniące i skutkować bardziej zmiennymi wyjściami ROS.
   3. Przygotować roztwór reakcyjny zawierający 100 μM luminolu, 10 μg/ml peroksydazy chrzanowej (HRP) i pożądane stężenie elicitora (na przykład: elf18 przy 1 nM, 10 nM, 100 nM lub 1000 nM) w sterylnym ddH₂O, używając 10 ml roztworu na jedną płytkę 96-dołkową.
      nuta: Rozpuścić liofilizowane peptydy w sterylnym_H2Ow probówkach o niskiej zdolności wiążącej, aby uzyskać zapas o masie 10 mM, błyskawicznie zamrozić w cieczy_N2 i przechowywać w temperaturze -80 °C. Gotowe do użycia rozcieńczyć zapasy w sterylnym_H2O, aby uzyskać 100 μM materiału roboczego i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   4. Za pomocą pipety wielokanałowej dozuj 100 μl mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka, dodając roztwór do wszystkich krążków liściowych tego samego zabiegu w tym samym czasie. Należy uwzględnić reakcję kontrolną (bez elicytora) dla każdego genotypu w celu oceny podstawowych poziomów ROS w przypadku braku wywołania. Natychmiastowy pomiar emisji światła dla wszystkich długości fal w widmie widzialnym za pomocą czytnika mikropłytek.
      nuta: Przygotować i nanieść roztwór reakcyjny w słabym świetle, ponieważ luminol i HRP są odczynnikami wrażliwymi na światło. Odczynniki należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze -20°C, chyba że są używane.
   5. Zmierz emisję światła z czasem całkowania 1 000 ms w odstępach 2-minutowych w okresie 40-60 minut w czytniku mikropłytek w celu uchwycenia dynamicznego wybuchu oksydacyjnego (rysunek 1D).
      nuta: Użyj dłuższego czasu integracji, aby poprawić czułość testu, zapewniając jednocześnie, że wszystkie próbki na płytce 96-dołkowej mogą być mierzone w jednym przedziale czasu.

Wyniki

Rysunek 1. Test wybuchu oksydacyjnego na bazie luminolu po indukcji immunologicznej u Arabidopsis. (A) Uprawiaj rośliny na glebie w warunkach dnia krótkiego przez 4-5 tygodni. (B) Użyj stempla do biopsji o średnicy 4 mm, aby zebrać krążki liściowe z każdej rośliny i odzyskać przez noc w ddH2O. (C) Dodać roztwór reakcyjny (100 μM luminolu, 10 μg/ml HRP i żądane stężenie elicytora) i zmierzyć...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
20-20-20 Nawóz	Produkt roślinny	Numer katalogowy: 10529	Wymieszaj 1 g / l z wodą i stosuj na rośliny co 2 tygodnie, aby uzyskać optymalny wzrost.
Dziurkacz do biopsji 4 mm	Sklep medyczny	232-33-34-P	Można również użyć zestawu świdrów korkowych o powierzchni 0,125 cm^2.
Pipeta wielokanałowa BioHit mLine Mechanical 12 (30-300 uL)	Sartorius Sartorius (Wyspa	Numer katalogowy: 725240	Można użyć dowolnej pipety wielokanałowej, a w razie potrzeby pojedynczej pipety.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	CP7211	Przechowuj 10 mM peptydu podstawowego w temperaturze -80C w probówkach o niskiej zawartości białka. Po rozmrożeniu przechowywać 100 uM zapasu roboczego w temperaturze -20C.
Kleszcze	Fisher Naukowy	22-327379
Peroksydaza chrzanowa	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P6782	Rozpuścić w czystej wodzie. Przechowywać w temperaturze -20C i z dala od światła.
Luminol (Luminol)	Sigma-Aldrich	A8511	Rozpuścić w DMSO. Przechowywać w temperaturze -20C i z dala od światła.
Sole bazalne Murisage i Skoog	Laboratoria Cedarlane	MSP09-100LT	Przechowywać w temperaturze 4C.
gleba	Ogrodnictwo SunGrow	Słoneczna mieszanka #1	Do uprawy rzodkiewnika można również wykorzystać inne rodzaje gleby. Wymieszaj z wodą podczas napełniania doniczek.
Wielomodowy czytnik mikropłytek SpectraMax Paradigm z modułem LUM	Urządzenia molekularne		Do tych testów można użyć dowolnego czytnika płytek zdolnego do wykrywania luminescencji.
Białe płytki 96-dołkowe z polistyrenu	Fisher Naukowy	07-200-589

Sar powiedział: powiedział: powiedział: