Pomiar indukowanego przez układ odpornościowy zahamowania wzrostu siewek

Streszczenie

Źródło: Bredow, M. et al., Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assay u Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147),(2019).

Ten film demonstruje test hamowania wzrostu siewek w roślinie Arabidopsis thaliana. Określa się wpływ zwiększonego stężenia elicytora peptydów immunologicznych na wzrost siewek.

Protokół

1. Test hamowania wzrostu siewek

1. Wysterylizuj nasiona i wysiewaj na płytkach Murashige i Skoog (MS).
   1. Przygotować sterylne podłoże o połowie mocy (0,5x) MS (2,16 g/l) zawierające 0,8% agaru [w/v]. Wlej media do płytek (90 x 15 mm) w okapie z przepływem laminarnym.
   2. Wysterylizuj około 100 nasion w probówce mikrowirówkowej, przemywając 1 ml 70% etanolu przez 2 minuty i usuwając przez aspirację. Dodaj 1 ml 40% wybielacza i delikatnie kołysz przez 17 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć wybielacz przez aspirację i umyć trzy razy w 1 ml sterylnej wody przez 5 minut. Zawiesić w 1 ml sterylnego 0,1% agaru.
      nuta: Alternatywnie można skorzystać z protokołu sterylizacji nasion chlorem gazowym24.
   3. Wysiewać około 100 nasion na genotyp na płytkach agarowych MS za pomocą pipety i uszczelnić taśmą mikroporową w kapturze z przepływem laminarnym.
      nuta: Unikaj umieszczania nasion w bliskiej odległości, ponieważ utrudni to późniejsze przesadzanie sadzonek.
   4. Rozwarstwiać nasiona, umieszczając płytki w temperaturze 4 °C (bez światła) przez 3-4 dni, aby zsynchronizować kiełkowanie (ryc. 1A).
2. Przeszczep sadzonki do 48-dołkowych płytek zawierających peptydy elicytorowe odporności.
   1. Po stratyfikacji przenieś płytki do światła w warunkach krótkiego dnia (22 °C, 10 godzin światła, natężenie światła 150 μE/^{m 2}/s i wilgotność względna 65-70%) na 3-4 dni, aby umożliwić kiełkowanie.
   2. W okapie z przepływem laminarnym przygotować roztwory peptydów elicytorowych (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM i 1,000 nM) w sterylnych 0,5 x MS płynnych pożywkach zawierających 1% sacharozy [w/v], używając 25 ml MS na każdą 48-dołkową płytkę. Przygotować płytki, pipetując 500 μl płynnego podłoża MS lub pożywki zawierającej peptydy MS do dołka. Jeśli to możliwe, użyj pipety do powtórnego przygotowania płytki, aby przyspieszyć proces.
      nuta: Dla każdego genotypu hoduj siewki w SM bez elicytora, aby uwzględnić wszelkie nieodłączne różnice we wzroście siewek.
   3. Za pomocą sterylnych kleszczy ostrożnie przesadź jedną sadzonkę do każdej studzienki o tej samej wielkości i wieku, upewniając się, że nie ma uszkodzenia sadzonki ani złamania korzenia i że korzeń jest zanurzony w podłożu. Dla każdego genotypu przeszczepić co najmniej 6-8 sadzonek do każdego rozcieńczenia peptydu (ryc. 1B).
      nuta: Przesadzaj sadzonki 4 dni po wykiełkowaniu, ponieważ krótkie korzenie są łatwiejsze do manipulowania, a starsze sadzonki mogą dawać mniej optymalne wyniki.
   4. Uszczelnij płytki taśmą z mikroporami i wróć do światła w standardowych warunkach dnia (22 °C, 10 godzin światła, natężenie światła 150 μE/^{m 2}/s i wilgotność względna 65-70%). Pozwól sadzonkom rosnąć przez 8-12 dni.

2. Określ procentowe zahamowanie wzrostu.

1. Ostrożnie wyjmij sadzonki z 48-dołkowych płytek i osusz je, przecierając je ręcznikiem papierowym. Zważyć sadzonki na wadze analitycznej i zapisać wartości. Jeśli to możliwe, użyj wagi analitycznej wyposażonej w wyjście USB, aby zapisać świeże wartości masy w arkuszu kalkulacyjnym. Przed zważeniem sadzonek zrób zdjęcie, aby wizualnie pokazać zahamowanie wzrostu (ryc. 1C).
2. Określić procentowe zahamowanie wzrostu sadzonek traktowanych elicytorem w porównaniu z siewkami uprawianymi w MS tylko w następujący sposób:
   
3. Wykreślaj dane za pomocą wykresu słupkowego ze słupkami błędu standardowego lub przy użyciu wykresu pudełkowego i wąsów, aby lepiej wyświetlić wariancję międzyeksperymentalną.

Wyniki

Rysunek 1. Test zahamowania wzrostu siewek wywołany elicytorem u Arabidopsis. (A) Wysiewaj siewki na agarze MS i rosnąć przez 3-4 dni w standardowych warunkach dnia krótkiego. (B) Przesadzać siewki na 48-dołkowe płytki zawierające pożywkę MS lub MS zawierające różne stężenia elf18. (C) Po 8-12 dniach oceń wzrokowo wielkość siewki, a następnie zmierz świeżą masę za pomocą skali analitycznej,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
8-dołkowe sterylne płytki z pokrywką	Sigma-Aldrich	CLS3548
Skala analityczna z Draft Sheid	Firma VWR	VWR-225AC	Do testów inicjacji wzrostu można użyć dowolnej standardowej skali analitycznej, jednak optymalne jest bezpośrednie wyjście komputerowe.
Pipeta wielokanałowa BioHit mLine Mechanical 12 (30-300 uL	Sartorius Sartorius (Wyspa	Numer katalogowy: 725240	Można użyć dowolnej pipety wielokanałowej, a w razie potrzeby pojedynczej pipety.
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	CP7211	Przechowuj 10 mM peptydu podstawowego w temperaturze -80 stopni C w probówkach o niskiej zawartości białka. Po rozmrożeniu przechowywać 100 μM materiału roboczego w temperaturze -20 st. C.
Sole bazalne Murisage i Skoog	Laboratoria Cedarlane	MSP09-100LT	Przechowywać w temperaturze 4 st. C.
Białe płytki 96-dołkowe z polistyrenu	Fisher Naukowy	07-200-589

Sar powiedział: