UWAGA: Protokół ma zastosowanie do różnych tkanek roślinnych. Pochwa ryżowa i krążki liściowe zostały użyte w tym protokole do wykrywania ROS po wywołaniu PAMP. Ponieważ różnice wynikają głównie z metody pobierania próbek, poniżej opisano jedynie wspólne procedury, przy czym w razie potrzeby wymieniono konkretne etapy.
1. Przygotowanie tkanek i obróbka wstępna
- Pochwa ryżowa
- Pochewkę z 10-dniowych sadzonek ryżu należy przeciąć na segmenty o średnicy 3 mm za pomocą ostrej żyletki lub ostrza chirurgicznego w celu wstępnego leczenia na 1 dzień przed testem ROS (ryc. 1B).
- Umieścić pięć segmentów osłonki w pojedynczym dołku 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej zawierającej 100 μl podwójnie destylowanej wody (ddH2O) przez 10-12 godzin, w ciemności w temperaturze 25 °C, co pozwala na zmniejszenie wycieku jonów związanego z urazem rany i osłabienie reakcji obronnych (ryc. 2).
nuta: Dbanie o to, aby cięcia były ustawione w pionie, aby zapewnić stałą powierzchnię cięcia wystawioną na działanie roztworu elicytacyjnego, jest ważnym krokiem do uzyskania wysoce powtarzalnych wyników. Delikatnie przesuwaj segmenty. Nie wykonuj dodatkowych nacięć ani ran na segmentach, które mogą być źródłem zmienności danych. Zasadniczo każde badanie musi zawierać co najmniej pięć powtórzeń, ponieważ zmienność wartości ROS jest duża. Im więcej replikacji, tym bardziej wiarygodne są dane.
- Tarcza liściowa
- Odetnij krążki liściowe (o średnicy 4 mm) z 4-6-tygodniowych roślin ryżu za pomocą stempla biopsyjnego z tłokiem. Talerze liściowe należy zawsze przycinać od środkowej jednej trzeciej drugiego liścia (ponumerowanego od góry) głównego glebogryzarki, aby zmniejszyć zmienność danych (Rysunek 1C).
- Umieścić jeden krążek liściowy w pojedynczym dołku 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania zawierającej 100 μl ddH2O przez 10-12 godzin w celu obróbki wstępnej, co pozwala na zmniejszenie reakcji związanych z zranieniami, ponieważ mogą one zakłócać indukcję ROS przez PAMP (ryc. 2).
nuta: Ostrożnie obsługiwać talerze liściowe. Nie wykonuj dodatkowych nacięć ani ran na dyskach w eksperymencie, ponieważ może to spowodować różnice w danych. Indukcja ROS zachodzi głównie z komórek krawędzi cięcia, ponieważ powierzchnie tkanek ryżu (liście lub osłonki) pokryte są warstwami hydrofobowymi. Tylko komórki przyciętych krawędzi stykają się z roztworem elicytacyjnym (patrz sekcja dyskusji).
- Utrzymuj wszystkie krążki liściowe unoszące się na wodzie, z powierzchnią odbąbkową skierowaną do góry, w dołkach płytki do mikromiareczkowania w celu wstępnego uzdatniania wody, aby uniknąć zmian związanych z bokiem liścia.
2. Przygotowanie roztworu elicytacyjnego
- Rozpuścić proszek L-012 w 20 mM (6,23 mg/ml) roztworze wodnym z ddH2O, aby uzyskać roztwór podstawowy. Następnie rozcieńczyć roztwór podstawowy 50 mM buforem Tris HCl (pH 7,5), aby uzyskać roztwór roboczy o końcowym stężeniu 500 μM L-012. Roztwór podstawowy należy przechowywać w stanie zamrożonym i rozcieńczyć do roztworu roboczego przed użyciem.
- Przygotować roztwór elicytacyjny zawierający PAMP, L-012 i peroksydazę chrzanową (HRP; 10 mg/ml w ddH2O). Aby uzyskać 10 ml roztworu elicytacyjnego, zmieszaj 9,4 ml 50 ml roztworu Tris HCl (pH 7,5), 400 μl roztworu L-012, 100 μl HRP i 100 μl flg22 (PAMP; 10 mM w ddH2O). Do kontroli ujemnej dodać 100 μl ddH2O zamiast PAMP.
nuta: Przygotowane roztwory elicytacyjne należy przechowywać w temperaturze pokojowej, aby uniknąć stresu związanego z zimnem w tkankach ryżowych. W razie potrzeby do leczenia można również stosować inne PAMP, takie jak chityna (20 ng/ml w stężeniu końcowym). Ponieważ L-012 jest wrażliwy na światło, wszystkie probówki zawierające roztwór L-012 należy przykryć folią aluminiową.
3. Uruchamianie oprogramowania i konfiguracja protokołu z przywołanym czytnikiem mikropłytek (patrz Tabela materiałów)
UWAGA: Ustawienie parametrów oprogramowania czytnika mikropłytek zajmuje trochę czasu. Zaleca się przygotowanie maszyny i protokołu (jedno kliknięcie, aby kontynuować) przed dodaniem roztworu elicytacyjnego.
- Uruchom oprogramowanie. Kliknij przycisk Eksperymenty, aby utworzyć nowy protokół lub użyć istniejącego.
- Kliknij opcję Procedura w oknie podręcznym, aby skonfigurować tabliczkę. Wybierz studzienki z płyty, które mają być monitorowane.
- Kliknij przycisk Start Kinetic, aby ustawić całkowity czas pracy i interwał odczytu. Ustaw czas działania na 35 minut lub dłużej, w zależności od wymagań eksperymentalnych. Aby uzyskiwać odczyty tak często, jak to możliwe, wybierz Minimalny interwał. Jako czas integracji wybierz 1 s lub dłużej, w zależności od intensywności sygnału.
UWAGA: Interwał odczytu zależy od liczby próbek i czasu integracji sygnału.
- Kliknij przycisk Sprawdź poprawność | OK, aby potwierdzić ustawienia.
- Kliknij Wykryj nową blachę w wyskakującym okienku i poczekaj, aż oprogramowanie wyświetli monit o wyświetlenie okna dialogowego płyty obciążenia. Umieść tabliczkę, która ma być testowana, na nośniku.
- Zatrzymaj się tutaj, aby poczekać na ustanowienie systemu elicytacji (w następnej sekcji). Jak tylko system elicytacyjny będzie gotowy, kliknij Uruchom, aby rozpocząć odczyt.
4. Ustanowienie systemu pozyskiwania i mierzenie produkcji ROS w czasie rzeczywistym
- Ostrożnie usunąć ddH2O z dołków zawierających wstępnie poddane obróbce tkanki, unikając uszkodzenia lub wysuszenia tkanek.
- Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 200 μl roztworu elicytacyjnego do studzienek zawierających tkanki.
- Delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć wykrywanie.
nuta: Dzięki zabiegowi PAMP tkanki roślinne reagują i bardzo szybko wytwarzają ROS. Dlatego sugeruje się, aby najpierw poddać działaniu kontroli negatywnej bez PAMP, aby skrócić czas operacji, gdy stosuje się wiele zabiegów. Działaj tak szybko, jak to możliwe, aby zmniejszyć opóźnienie wywołania między zabiegami. Im krótszy czas między dodaniem roztworu elicytacyjnego a rozpoczęciem wykrywania, tym lepsze będzie uchwycenie ważnych danych eksperymentalnych.
